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核心问题：研究 Pantoea ananatis 番茄红素环化酶编码基因 crtY 在大肠杆菌中的非 ATG 替代翻译起始位点，并探讨其进化保守性。
关键发现：在 E. coli 中，P. ananatis crtY 的翻译起始不依赖 ATG，内部 Val10 (GTG) 可作为替代起始密码子；将 GTG 替换为 GTA 后仍保留弱活性，替换为 TTG 则失去环化功能。类胡萝卜素产量：pTB-EIBY 产 β-胡萝卜素
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代谢工程
Alternative translationGTG start codonLycopene cyclasePantoea ananatisTranslational reinitiation
Escherichia coli DH5α
Escherichia coli DH5α
核心问题：水稻胚乳缺乏类胡萝卜素生物合成的初始步骤，通过转基因表达八氢番茄红素合酶、脱氢酶和细菌β-胡萝卜素酮化酶来合成高价值虾青素时，意外产生一种不符合预期途径的未知类胡萝卜素副产物，需对其进行结构鉴定并阐明形成机制。
关键发现：转基因水稻愈伤组织中积累了虾青素（HPLC 保留时间
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代谢工程
4-keto-α-caroteneAstaxanthinCarotenoid biosynthesisGenetic engineeringRice endosperm
水稻胚乳来源愈伤组织
水稻胚乳来源愈伤组织
水稻胚乳来源愈伤组织
核心问题：人芳香化酶（P450arom/CYP19）因其疏水性和不稳定性，难以在大肠杆菌中高效表达、纯化和进行详细结构与功能研究。
关键发现：NmA264R在大肠杆菌中表达量约350-400 nmol/L培养物（共表达GroES/GroEL），NmA264C在氯霉素诱导下约240 nmol/L
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代谢工程
AndrogenAromatase inhibitorsEPREstrogenPolymorphism
Escherichia coli DH5α
Escherichia coli DH5α
Escherichia coli
核心问题：大肠杆菌中α-法尼烯产量低，主要受限于植物倍半萜合酶异源表达差以及FPP前体供应不足。
关键发现：最终工程菌株E. coli ispALaFS-NA在含有3.0%（v/v）甘油和0.1 mM IPTG的2YT培养基中培养48 h，α-法尼烯产量达380.0 mg/L，较初始菌株E. coli wFS的1.2 mg/L提高约317倍。密码子优化使产量提高1.3倍
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代谢工程
Codon optimizationFPP synthesisMevalonate pathwayProtein fusionα-Farnesene
Escherichia coli DH5α
Escherichia coli DH5α
Escherichia coli DH5α
核心问题：大肠杆菌中尚未实现Z型法尼基焦磷酸（Z-type FPP）的合成，需要构建能产生Z,E-FPP的工程菌株，以用于合成特定倍半萜。
关键发现：含MVA途径底部模块和融合FPP合酶（ILRv）的大肠杆菌在含1%（v/v）甘油和5mM甲羟戊酸的2YT培养基中，Z,E-法尼醇（Z,E-FOH）产量达115.6 mg/L，占总FOH产量的80.7%（总FOH 143.3 mg/L）
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代谢工程
FPP synthaseProtein fusionSesquiterpeneZ,E-FPPZ,E-Farnesol
Escherichia coli DH5α
Escherichia coli DH5α
Escherichia coli DH5α
核心问题：如何简单高效地调控代谢通路基因表达，平衡甲羟戊酸（MVA）通路通量，减轻代谢负担和毒性中间产物积累，从而提高萜类化合物（异戊二烯、α-红没药醇、番茄红素）产量。
关键发现：双靶向CRISPRi（T7RNAP和GFP）实现最高27倍抑制（7-27倍），单靶向仅1.7-3.9倍
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代谢工程
CRISPR interferenceEscherichia coliMevalonate pathwayTerpenoid
Escherichia coli DH5α...
Escherichia coli DH5α...
Escherichia coli DH5α...
核心问题：鉴定嗜热嗜酸古菌 Sulfolobus solfataricus 基因组中类胡萝卜素生物合成基因簇内未知基因 SSO2904 的功能，揭示其编码新型融合型番茄红素β-环化酶。
关键发现：重组表达 SSO2904 后，大肠杆菌细胞中积累 β-胡萝卜素，菌落颜色由红色变为红橙色
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代谢工程
ArchaeaCarotenoidCyclaseEvolutionLycopeneLycopene β-cyclase
Sulfolobus solfataricus
Escherichia coli DH5α
Sulfolobus solfataricus
核心问题：在细菌中实现人UDP-葡萄糖醛酸转移酶1A1 (UGT1A1) 的活性表达。之前在大肠杆菌中表达UGT蛋白无法检测到催化活性，推测是由于大肠杆菌内源β-葡萄糖醛酸苷酶分解了葡萄糖醛酸结合产物。
关键发现：人UGT1A1在沙门氏菌TA1535中成功表达，IPTG诱导后24小时表达量最高
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代谢工程
β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂人UGT1A1异源表达葡萄糖二酸1,4-内酯鼠伤寒沙门氏菌
Salmonella typhimuriu...
Salmonella typhimuriu...
Escherichia coli DH5α
核心问题：研究Cys-295在Thermoanaerobacter ethanolicus二级醇脱氢酶（SADH）小烷基结合口袋中的作用，通过定点突变解析该残基对酮还原对映选择性和底物特异性的影响。
关键发现：C295A SADH比活力为43 U/mg，略低于野生型的54 U/mg
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酶工程
Thermoanaerobacter ethanolicusenantioselectivityketone reductionsecondary alcohol dehydrogenasesite-directed mutagenesissubstrate specificity
Thermoanaerobacter et...
Thermoanaerobacter br...
Escherichia coli DH5α
核心问题：现有分析脂质连接寡糖（LLO）的方法依赖放射性标记和色谱分离，难以快速、准确地提供结构信息。需要开发一种免放射性标记、能直接检测和表征 LLO 的新方法，以研究原核和真核 N-糖基化途径。
关键发现：该方法对纯化的 Und-PP-庚糖检测限达亚皮摩尔级
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代谢工程
Campylobacter jejuniN-glycosylationcapillary electrophoresis-mass spectrometryglycoengineeringlectin affinity capturelipid-linked oligosaccharides
Campylobacter jejuni ...
Escherichia coli DH5α
Escherichia coli SCM7
核心问题：植物单萜合酶在工程菌中产量低、产物纯度差，且缺乏细菌单萜合酶的结构信息，限制了其催化机制理解和蛋白工程改造。
关键发现：在工程大肠杆菌中，bLinS产生芳樟醇的产量为363.3±57.9 mg/L有机相，比植物源RLinS_Aa（1.3 mg/L）高约300倍
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代谢工程 / 合成生物学
molecular dynamics simulationsmonoterpene synthasemonoterpenoidsprotein crystallographysesquiterpene synthaseterpenes
Escherichia coli DH5α
Escherichia coli DH5α
Escherichia coli Arct...
核心问题：传统P450工程酶的筛选方法无法快速评估其区域选择性，常需耗时费力的HPLC或GC分析，难以高效筛选具有所需选择性的P450催化剂。
关键发现：从~10,000个重组子中筛选出1220个催化活性P450变体（阈值：至少一个探针活性>20%亲本），其中261个（21%）具有独特指纹。对6、8、10的活性预测正确率为87-97%，对7、9、11为90-100%
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酶工程
P450 fingerprintingcytochrome P450high-throughput screeningprotein engineeringregioselectivityterpene hydroxylation
Escherichia coli DH5α
Escherichia coli DH5α
Escherichia coli DH5α
核心问题：阐明phomopsene合酶（PaPS）催化二萜环化生成phomopsene的反应机制，为萜烯环化酶的理性工程改造提供基础。
关键发现：['EI-MS分析仅需约10 ng样品，灵敏度比NMR高>100倍', '在phomopsene的EI-MS谱中观察到主要碎片离子m/z 257、202、160、145，以及243、216等
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合成生物学
EI-MSchemoenzymatic synthesiscyclization mechanismdeuterium-labeled GGPPphomopsene synthaseterpene cyclase
Escherichia coli BL21...
Escherichia coli DH5α
Escherichia coli BL21...
核心问题：缺乏高通量筛选多种挥发性萜烯产物的方法，阻碍了萜烯合酶的定向进化，难以改造其产物谱。
关键发现：筛选了约1000个菌落，鉴定出超过65个独特序列
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代谢工程
GC-MSautomated pipelinedirected evolutionhigh-throughput screeningmonoterpene synthasepinene synthase
Escherichia coli DH5α
Escherichia coli DH5α
Escherichia coli DH5α
核心问题：探索利用细胞色素P450cam和P450BM-3对倍半萜(+)-valencene进行生物氧化，以合成高价值香料(+)-nootkatone，并解决野生酶活性低、选择性差及产物抑制等问题。
关键发现：野生型P450cam不能氧化(+)-valencene，但F87A/Y96F突变体显示NADH周转速率36 nmol (nmol P450)^-1 min^-1，氧化速率7.2 min^-1，偶联效率20%，产物中(+)-trans-nootkatol占70%、(+)-nootkatone占12%
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代谢工程
(+)-valenceneP450BM-3biotransformationcytochrome P450camnootkatonesesquiterpene oxidation
Escherichia coli DH5α
Pseudomonas putida
核心问题：人法尼基二磷酸（FPP）合酶在天然肝组织中含量低且难以大量获得，限制了对其机理、结构和抑制剂的研究。
关键发现：从149 mg粗提物中纯化得到1.8 mg均一重组人FPP合酶融合蛋白，总回收率64%，纯化倍数52倍
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酶工程
Escherichia colicholesterol biosynthesisfarnesyl diphosphate synthaseisoprenoid biosynthesisprenyltransferaseprotein purification
Escherichia coli DH5αFIQ
核心问题：从粟酒裂殖酵母中分离编码异戊烯基二磷酸异构酶（IPP isomerase）的cDNA，并实现该酶在大肠杆菌中的异源合成，以用于比较研究和序列分析。
关键发现：克隆的粟酒裂殖酵母IPP异构酶cDNA编码227个氨基酸的蛋白，预测分子量26,864道尔顿
等 5 条
代谢工程
Escherichia coliSchizosaccharomyces pombecDNA cloningcomplementationisopentenyl diphosphate isomeraseplasmid shuffle
Saccharomyces cerevis...
Schizosaccharomyces p...
Escherichia coli JM101
核心问题：构建无需外源电子传递蛋白的自足P450cam催化体系，使大肠杆菌能直接催化底物氧化
关键发现：优化得到的PdR-Pd-P450cam融合蛋白最高催化活性kcat=30 min^-1
等 6 条
代谢工程
樟脑氧化电子传递细胞色素P450cam自足催化系统融合蛋白
Escherichia coli DH5α
Escherichia coli DH5α
Escherichia coli DH5α
核心问题：阐明法尼基二磷酸(FPP)合酶中位于第一个天冬氨酸富集基序前第五位氨基酸残基(第81位)如何决定最终产物链长
关键发现：野生型FPP合酶以FPP(C15)为最终产物
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酶工程
chain length determinationfarnesyl diphosphate synthaseprenyltransferaseproduct specificitysite-directed mutagenesis
Escherichia coli DH5α
核心问题：阐明大肠杆菌O157中O抗原重复单元四糖生物合成的起始步骤，尤其是GalNAc-P-P-undecaprenol的生成机制；验证WecA是否直接利用UDP-GalNAc，并发现新的表异构酶。
关键发现：['膜制剂实验中，K12、PR4019、O157均不能利用UDP-[3H]GalNAc形成标记糖脂（<0.01）；而用UDP-[3H]GlcNAc时，10分钟内K12产生GlcNAc-P-P-Und
等 4 条
合成生物学
Escherichia coli O157GalNAc-P-P-undecaprenolGlcNAc-P-P-undecaprenolO-antigenWecAepimerase
Escherichia coli O157
Escherichia coli (K12...
Escherichia coli DH5α