A novel carotenoid, 4-keto-α-carotene, as an unexpected by-product during genetic engineering of carotenogenesis in rice callus
- 作者
- Jürgen Breitenbach, Chao Bai, Sol M. Rivera, Ramon Canela, Teresa Capell, Paul Christou, Changfu Zhu, Gerhard Sandmann
- 单位
- Molecular Biosciences, J.W. Goethe Universität Frankfurt, Max von Laue Str. 9, D-60438 Frankfurt am Main, Germany; Departament de Producció Vegetal i Ciència Forestal, Universitat de Lleida-Agrotecnio Center, Avenida Alcalde Rovira Roure, 191, Lleida E-25198, Spain; Departament de Química, Universitat de Lleida, Avenida Alcalde Rovira Roure, 191, Lleida-E-25198, Spain; Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats, Barcelona, Spain
- 杂志
- Phytochemistry（2014）
- DOI
- 10.1016/j.phytochem.2013.12.008
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
水稻胚乳缺乏类胡萝卜素生物合成的初始步骤，通过转基因表达八氢番茄红素合酶、脱氢酶和细菌β-胡萝卜素酮化酶来合成高价值虾青素时，意外产生一种不符合预期途径的未知类胡萝卜素副产物，需对其进行结构鉴定并阐明形成机制。
研究策略
采用组合转化策略，将玉米八氢番茄红素合酶（Zmpys1）、Pantoea ananatis 八氢番茄红素脱氢酶（Pacrt1）和 Brevundimonas sp. SD212 β-胡萝卜素酮化酶（CrtW）基因导入水稻胚乳来源愈伤组织，利用水稻内源环化酶和羟化酶延伸合成虾青素。对未知副产物通过 HPLC 共色谱、化学还原、UHPLC-MS 质谱分析以及在大肠杆菌中重建生物合成途径进行结构鉴定。
核心内容
该研究通过组合转化策略，将玉米八氢番茄红素合酶、Pantoea ananatis 八氢番茄红素脱氢酶和 Brevundimonas sp. SD212 β-胡萝卜素酮化酶（CrtW）基因导入水稻胚乳来源愈伤组织，尝试建立合成高价值虾青素的代谢途径。研究中意外发现一种不符合预期途径的未知类胡萝卜素副产物，经 HPLC 共色谱、化学还原、UHPLC-MS 分析及在大肠杆菌中重建生物合成途径进行结构鉴定，确定其为一种新的天然类胡萝卜素 4-酮-α-胡萝卜素（β,ε-胡萝卜素-4-酮），分子量为 551 g/mol，HPLC 保留时间 12.2 min，最大吸收波长 452 nm。该副产物由细菌酮化酶 CrtW 对 α-胡萝卜素的 β-离子酮环发生酮化反应生成，表明该酶具有超出预期的底物谱，这一分支反应造成了代谢流向虾青素的损失。转基因愈伤组织中虾青素积累的 HPLC 保留时间为 6.7 min，最大吸光度 475 nm。该发现揭示了外源酮化酶在内源代谢背景下的意外交叉反应，同时提出通过 RNAi 或反义技术下调水稻内源番茄红素 ε-环化酶以减少 α-胡萝卜素积累、避免副产物形成、提高虾青素合成效率的策略，为植物类胡萝卜素代谢工程的优化提供了重要参考。
创新点
首次发现并鉴定了一个新的天然类胡萝卜素 4-酮-α-胡萝卜素（β,ε-胡萝卜素-4-酮）；揭示了细菌酮化酶 CrtW 具有超出预期的底物谱，能作用于 α-胡萝卜素的 β-离子酮环；提出通过 RNAi/反义下调水稻内源番茄红素 ε-环化酶以避免该副产物形成的策略。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 水稻胚乳来源愈伤组织 | 类胡萝卜素生物合成途径 | Zmpys1 | 八氢番茄红素合酶 (phytoene synthase) | 催化 | 来自玉米，催化 GGPP 缩合生成八氢番茄红素 |
| 水稻胚乳来源愈伤组织 | 类胡萝卜素生物合成途径 | Pacrt1 | 八氢番茄红素脱氢酶 (phytoene desaturase) | 催化 | 来自 Pantoea ananatis，催化八氢番茄红素四步脱氢及异构化为番茄红素 |
| 水稻胚乳来源愈伤组织 | 类胡萝卜素生物合成途径 | CrtW | β-胡萝卜素酮化酶 (carotene ketolase) | 催化 | 来自 Brevundimonas sp. SD212，能酮化 β-胡萝卜素和玉米黄质，也可作用于 α-胡萝卜素的 β-环生成 4-酮-α-胡萝卜素 |
| 水稻胚乳来源愈伤组织 | 类胡萝卜素生物合成途径 | 内源番茄红素环化酶（lycopene cyclases） | 番茄红素 β/ε-环化酶 | 催化 | 水稻内源酶，将番茄红素环化生成 α-胡萝卜素和 β-胡萝卜素 |
| 水稻胚乳来源愈伤组织 | 类胡萝卜素生物合成途径 | 内源β-胡萝卜素羟化酶 | β-胡萝卜素羟化酶 (β-carotene hydroxylase) | 催化 | 与酮化酶协同作用，将 β-胡萝卜素转化为虾青素 |
| Escherichia coli DH5α | 类胡萝卜素生物合成途径（参考化合物合成） | lycopene ε-cyclase (AtLCYe), crtO, crtT, crtY 等 | 番茄红素 ε-环化酶、CrtO 酮化酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素环化酶等 | 催化 | 用于构建 4-酮-α-胡萝卜素和 4-酮-β-紫胡萝卜素标准品，以进行结构比对 |
关键发现
- 转基因水稻愈伤组织中积累了虾青素（HPLC 保留时间
- 7 min，最大吸光度 475 nm）及 α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、4-酮-玉米黄质和 Echinone 等中间产物。未知副产物（HPLC 峰 3）保留时间为
- 2 min，最大吸收波长为 452 nm，比 Echinone 低 14 nm；UHPLC-MS 显示 [M+H]+ 为 m/z 552，对应分子量 551 g/mol；经 HPLC 共色谱、NaBH4 还原及大肠杆菌合成标准品对比，确定其为 4-酮-α-胡萝卜素。该副产物由细菌酮化酶对 α-胡萝卜素 β-环的酮化反应生成，导致代谢流向虾青素的分支损失。
研究结论
遗传工程成功在水稻胚乳中建立了合成虾青素的酮化途径，但外源细菌酮化酶同时作用于 α-胡萝卜素产生副产物 4-酮-α-胡萝卜素，该副产物分支自β-胡萝卜素-虾青素途径。通过进一步基因工程（如反义或 RNAi 抑制内源番茄红素 ε-环化酶以减少 α-胡萝卜素积累）可以避免该副产物的形成，提高虾青素合成效率。