Structural basis of catalysis in the bacterial monoterpene synthases linalool synthase and 1,8-cineole synthase
- 作者
- Vijaykumar Karuppiah, Kara E. Ranaghan, Nicole G. H. Leferink, Linus O. Johannissen, Muralidharan Shanmugam, Aisling Ní Cheallaigh, Nathan J. Bennett, Lewis J. Kearsey, Eriko Takano, John M. Gardiner, Marc W. van der Kamp, Sam Hay, Adrian J. Mulholland, David Leys, Nigel S. Scrutton
- 单位
- Manchester Synthetic Biology Research Centre for Fine and Specialty Chemicals (SYNBIOCHEM), Manchester Institute of Biotechnology, School of Chemistry, Faculty of Science and Engineering, University of Manchester; Centre for Computational Chemistry, School of Chemistry, University of Bristol
- 杂志
- ACS Catalysis（2017）
- DOI
- 10.1021/acscatal.7b01924
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
植物单萜合酶在工程菌中产量低、产物纯度差，且缺乏细菌单萜合酶的结构信息，限制了其催化机制理解和蛋白工程改造。
研究策略
解析细菌单萜合酶bLinS和bCinS的晶体结构（含氟化底物类似物复合物），结合分子动力学模拟、EPR光谱和体内外生化表征，阐明催化机制并指导代谢工程应用。
核心内容
该研究解析了细菌单萜合酶bLinS（芳樟醇/橙花叔醇合酶）和bCinS（1,8-桉叶素合酶）的高分辨率晶体结构，包括与氟化底物类似物的复合物结构（bCinS-FNPP分辨率为1.63 Å，bLinS-FGPP为1.82 Å），并结合分子动力学模拟、EPR光谱和体内外生化表征阐明了催化机制。结果显示，细菌单萜合酶结构更接近倍半萜合酶，其活性位点残基决定底物特异性：bCinS中Phe77和Phe179限制底物结合腔使其仅接受GPP，而bLinS对应位置为Thr75和Cys177，可同时利用GPP和FPP。在工程大肠杆菌中，bLinS产芳樟醇达363.3 mg/L有机相，比植物源酶高约300倍；bCinS产1,8-桉叶素116.8 mg/L，纯度96%，显著优于三种植物源合酶。该工作证明细菌单萜合酶是更适用于单萜微生物生产的催化剂，其结构信息为定向改造以扩展产物谱系提供了分子基础。
创新点
首次解析细菌单萜合酶bLinS和bCinS的高分辨晶体结构；证明细菌单萜合酶结构更接近倍半萜合酶；阐明活性位点残基控制产物特异性的结构基础；展示其在工程大肠杆菌中优于植物源酶的生产性能。
研究对象（14）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸（MVA）途径及单萜合成模块 | bLinS（linalool/nerolidol synthase） | bLinS（linalool/nerolidol synthase） | 催化 | 来自Streptomyces clavuligerus，催化GPP生成R-(-)-芳樟醇，也可转化FPP生成trans-橙花叔醇 |
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸（MVA）途径及单萜合成模块 | bCinS（1,8-cineole synthase） | bCinS（1,8-cineole synthase） | 催化 | 来自Streptomyces clavuligerus，催化GPP或NPP生成1,8-桉叶素（96%纯度） |
| Escherichia coli ArcticExpress (DE3) | 单萜生物合成（体外酶催化） | bLinS、bCinS | bLinS、bCinS | 催化 | 用于蛋白表达纯化，体外生物转化GPP生成相应产物 |
| Escherichia coli（工程菌株） | 异源MVA途径 + GPPS模块 | AgtrGPPS2（来自Abies grandis的截短型香叶基焦磷酸合酶） | AgtrGPPS2 | 催化 | 生成GPP，为单萜合酶提供底物 |
| Escherichia coli（工程菌株） | 甲羟戊酸（MVA）途径 | pMVA模块中的MVA途径基因 | MVA途径酶 | 能量供给 | 提供IPP和DMAPP前体，增强单萜产量 |
| 无细胞体系 | 单萜生物合成 | bCinS | bCinS | 催化 | 体外转化NPP（2 mM）亦产生1,8-桉叶素 |
| 无细胞体系 | 单萜生物合成 | bLinS | bLinS | 催化 | 体外转化GPP（2 mM）产生芳樟醇，无副产物 |
| Escherichia coli | 萜类前体合成 | 内源FPP合酶（IspA） | FPP合酶 | 催化 | 产生FPP，使bLinS生成橙花叔醇 |
| Escherichia coli | 内源磷酸酶途径 | phoA、pgpB、ybjG | PhoA、PgpB、YbjG | 转运 | 将GPP/FPP水解为香叶醇/法尼醇，产生副产物 |
| Escherichia coli | 底物结合 | bCinS中的Phe77、Phe179 | bCinS | 调控 | 芳香族残基限制活性腔体积，决定只能利用C10底物 |
| Escherichia coli | 底物结合 | bLinS中的Thr75、Cys177 | bLinS | 调控 | 非芳香残基使活性腔能容纳C15底物FPP |
| Escherichia coli | 催化机制 | bCinS中的Trp58、Asn305 | bCinS | 区室化 | 配位一个水分子，作为亲核试剂攻击萜品基阳离子，导向1,8-桉叶素形成 |
| Escherichia coli | 催化机制 | bLinS中的Asp79、Arg172 | bLinS | 调控 | 配位水分子，水分子攻击C3生成R-(-)-芳樟醇 |
| 无细胞体系（EPR实验） | 金属离子结合 | bLinS、bCinS | bLinS、bCinS | 能量供给 | 通过Mn2+替代Mg2+证明结合3个金属离子，为催化所必需 |
关键发现
- 在工程大肠杆菌中，bLinS产生芳樟醇的产量为363.3±57.9 mg/L有机相，比植物源RLinS_Aa（1.3 mg/L）高约300倍
- bCinS产生1,8-桉叶素产量为116.8±36.4 mg/L有机相，纯度96%，而植物源CinS_Sf为118.2 mg/L（67%纯度）、CinS_At为46.6 mg/L（42%纯度）、CinS_Cu为18.2 mg/L（63%纯度）。bLinS还能转化FPP产生橙花叔醇（159.1±7.3 mg/L），并生成R-(-)-芳樟醇和trans-橙花叔醇。bCinS-FNPP结构分辨率1.63 Å，bCinS-FNPP/FGPP结构1.51 Å，bLinS-FGPP结构1.82 Å，apo-bLinS结构2.38 Å。EPR证明bLinS和bCinS在溶液中结合3个Mn2+（等价于Mg2+）。MD模拟表明bLinS和bCinS反应循环中不发生大规模构象变化。bCinS中Phe77和Phe179限制底物结合腔，导致仅接受GPP
- bLinS对应位置为Thr75和Cys177，可同时接受GPP和FPP。
研究结论
细菌单萜合酶bLinS和bCinS是比植物源酶更适合单萜生产的生物催化元件；其结构为工程改造以扩展单萜产物谱系提供了基础，并揭示了单萜/倍半萜合酶底物特异性的关键决定残基。