CRISPR interference-guided balancing of a biosynthetic mevalonate pathway increases terpenoid production
- 作者
- Seong Keun Kim, Gui Hwan Han, Wonjae Seong, Haseong Kim, Seon-Won Kim, Dae-Hee Lee, Seung-Goo Lee
- 单位
- Synthetic Biology and Bioengineering Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), Daejeon 34141, Republic of Korea; Biosystems and Bioengineering Program, University of Science and Technology (UST), Daejeon 34113, Republic of Korea; Division of Applied Life Science (BK21 Plus), PMBBRC, Gyeongsang National University, Jinju 52828, Republic of Korea
- 杂志
- Metabolic Engineering（2017）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2016.08.006
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何简单高效地调控代谢通路基因表达，平衡甲羟戊酸（MVA）通路通量，减轻代谢负担和毒性中间产物积累，从而提高萜类化合物（异戊二烯、α-红没药醇、番茄红素）产量。
研究策略
开发一种可调控的CRISPR干扰（CRISPRi）系统，利用失活的Cas9（dCas9）和靶向特定基因的sgRNA，在转录水平剂量依赖地抑制MVA通路基因（如启动子K1和第一个酶mvaE）和必需基因ispA的表达，实现代谢通量平衡和细胞生长与产物合成的协调。
核心内容
本研究开发了一种基于失活Cas9（dCas9）的可调控CRISPR干扰（CRISPRi）系统，用于平衡大肠杆菌中甲羟戊酸（MVA）通路代谢通量，以提高萜类化合物产量。该系统利用L-鼠李糖剂量依赖地调控sgRNA表达，可在转录水平精确抑制MVA通路基因（如双功能酶mvaE）和必需基因ispA。在基因报告实验中，靶向sgRNA K1和E2分别抑制95.2%和96.7%的GFP表达；在操纵子环境中，K1对全部MVA基因抑制达81.6%。通过抑制mvaE，番茄红素产量达到47.6±5.1 mg/L，较对照提高8.2倍；在BL21(DE3)中采用种子培养期抑制、生产期解除的时序调控策略，番茄红素产量进一步升至71.4±8.5 mg/L（8.0倍提高），α-红没药醇产量提高10.6倍。此外，可逆抑制ispA使异戊二烯产量提高2.6倍，且后续表达MVA通路和异戊二烯合酶可恢复细胞生长率至95%。该研究证明CRISPRi是一种简单高效的基因表达微调平台，通过改变sgRNA序列即可实现代谢通量平衡、减轻毒性中间产物积累，为构建智能化微生物细胞工厂提供了通用策略。
创新点
1. 构建了包含dCas9和sgRNA的单一可调控CRISPRi质粒，实现L-鼠李糖剂量依赖的转录抑制；2. 在操纵子环境中成功调控整个MVA通路基因，证明CRISPRi可抑制距启动子约4kb的基因；3. 通过靶向mvaE基因有效平衡MVA通路通量，显著提高番茄红素和α-红没药醇产量并缓解生长抑制；4. 利用CRISPRi可逆调控必需基因ispA，提高异戊二烯产量同时保持细胞生长；5. 建立严格的时序调控策略，避免毒性中间产物积累。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α/BL21(DE3) | 甲羟戊酸（MVA）通路 | mvaE | MvaE（乙酰乙酰辅酶A硫解酶/HMG-CoA还原酶，双功能酶） | 催化 | MVA通路第一关键酶，CRISPRi主要靶点，抑制其表达可平衡通量并提高萜类产量 |
| Escherichia coli DH5α/BL21(DE3) | 甲羟戊酸（MVA）通路 | mvaS | MvaS（HMG-CoA合酶） | 催化 | 合成HMG-CoA，mvaS抑制未提高番茄红素产量 |
| Escherichia coli DH5α/BL21(DE3) | 甲羟戊酸（MVA）通路 | mvaK1 | MvaK1（甲羟戊酸激酶） | 催化 | MVA通路磷酸化步骤，sgRNA K1靶向启动子区域 |
| Escherichia coli DH5α/BL21(DE3) | 甲羟戊酸（MVA）通路 | mvaK2 | MvaK2（磷酸甲羟戊酸激酶） | 催化 | MVA通路磷酸化步骤 |
| Escherichia coli DH5α/BL21(DE3) | 甲羟戊酸（MVA）通路 | mvaD | MvaD（甲羟戊酸二磷酸脱羧酶） | 催化 | MVA通路脱羧步骤 |
| Escherichia coli DH5α/BL21(DE3) | 甲羟戊酸（MVA）通路 | idi | Idi（异戊烯基二磷酸异构酶） | 催化 | 催化IPP与DMAPP互变 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 萜类前体合成通路（MVA+MEP） | ispA | IspA（法尼基二磷酸合酶） | 催化 | 内源必需基因，催化IPP/DMAPP缩合生成FPP，抑制其表达可促进异戊二烯积累 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异戊二烯合成 | ispS | IspS（异戊二烯合酶，来自毛果杨） | 催化 | 催化DMAPP生成异戊二烯 |
| Escherichia coli DH5α/BL21(DE3) | α-红没药醇合成 | BBS | BBS（α-红没药醇合酶，来自德国洋甘菊） | 催化 | 催化FPP环化生成(-)-α-红没药醇 |
| Escherichia coli DH5α | 番茄红素生物合成 | crtEIB | CrtEIB（来自宏基因组，包括GGPP合酶、八氢番茄红素合酶等） | 催化 | 催化异戊烯基焦磷酸合成番茄红素 |
| Escherichia coli | CRISPR干扰（CRISPRi）系统 | dCas9 | dCas9（化脓性链球菌Cas9核酸酶失活突变体） | 调控 | 保留DNA结合活性，无核酸内切酶活性，在sgRNA引导下阻碍转录 |
| Escherichia coli | CRISPR干扰（CRISPRi）系统 | sgRNA | sgRNA（单向导RNA） | 调控 | 包含20bp靶向序列，引导dCas9结合目标DNA |
关键发现
- 双靶向CRISPRi（T7RNAP和GFP）实现最高27倍抑制（7-27倍），单靶向仅1.7-3.9倍
- 基因报告实验中，sgRNA K1和E2分别抑制95.2%和96.7%的GFP表达
- 操纵子报告实验中，K1对全部MVA基因抑制81.6%，E2对mvaE抑制88%
- 无IPTG条件下，抑制mvaE使番茄红素产量达47.6±5.1 mg/L（8.2倍提高），sgRNA(K1)为3.0倍提高
- IPTG存在时，K1+E2双靶向使番茄红素产量达17.0±0.5 mg/L，比单独pTM-CRT（1.89±0.2 mg/L）高9.0倍
- 1 mM L-鼠李糖下，mvaE抑制使番茄红素产量47.1±1.5 mg/L
- CRISPRi调控mvaE使含pTM-CRT质粒的细胞比例从4.7%提高到100%
- RBS工程降低MvaE表达使番茄红素达48±4.8 mg/L
- 在BL21(DE3)中，种子培养时抑制、生产时解除抑制使番茄红素产量达71.4±8.5 mg/L（8.0倍提高），α-红没药醇产量提高10.6倍
- 抑制ispA使异戊二烯产量提高2.6倍，但细胞生长速率降低80%，表达MVA通路和ispS后恢复至95%生长率
- 抑制ispA使α-红没药醇产量下降3.3倍。
研究结论
可调控CRISPRi系统是代谢工程中调节生物合成和内源基因表达的稳健平台，能够通过简单改变sgRNA序列实现基因表达微调，平衡代谢通量、减轻毒性、提高萜类产量，并可与细胞生长偶联，有望用于构建智能化微生物细胞工厂。