An automated pipeline for the screening of diverse monoterpene synthase libraries
- 作者
- Nicole G. H. Leferink, Mark S. Dunstan, Katherine A. Hollywood, Neil Swainston, Andrew Currin, Adrian J. Jervis, Eriko Takano, Nigel S. Scrutton
- 单位
- University of Manchester; Manchester Institute of Biotechnology; (其他单位未在文中列出完整信息)
- 杂志
- Scientific Reports（2019）
- DOI
- 10.1038/s41598-019-48452-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
缺乏高通量筛选多种挥发性萜烯产物的方法，阻碍了萜烯合酶的定向进化，难以改造其产物谱。
研究策略
建立基于机器人和GC-MS的自动化筛选流程，对松烯合酶（pinene synthase）突变体文库进行体内高通量筛选，结合自动化测序和数据分析。
核心内容
该研究建立了一套基于机器人液体处理平台与GC-MS联用的自动化筛选流程，用于高通量评估单萜合酶突变体文库的产物谱。作者以松烯合酶为对象，通过NBT简并密码子对三个可塑性区域进行定向突变，在大肠杆菌DH5α中借助甲羟戊酸通路和截短GPP合酶实现体内单萜合成。流程涵盖自动化菌落挑选、培养、萃取、GC-MS检测及数据分析，共筛选约1000个菌落，鉴定出超过65个独特序列；摇瓶放大验证中67个变体获得详细产物谱，覆盖所搜索序列空间的40%。结果显示区域1和区域3高度可塑，其中335位及557、559、560、561位突变可显著改变产物谱，而区域2突变主要产生香叶醇等线性产物，表明其参与碳正离子异构化或环化；445和446位任意突变均导致酶失活。NBT密码子中Gly和Cys出现频率最高（分别为14.0%和17.7%），Pro和Arg最低。部分变体如C335A、A557S、M559C/T/V在初始筛选中峰强度最高。该自动化流程有效富集了具有改变产物谱的活性变体，结果与摇瓶培养高度吻合，揭示了松烯合酶各可塑性区域在环化级联中的不同功能角色，为萜烯合酶的定向进化提供了高效工具。
创新点
自动化液体处理平台与GC-MS联用，可同时检测多种单萜产物；应用于松烯合酶变体文库，识别出改变产物谱的变体；通过NBT简并密码子定向突变三个可塑性区域。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸（MVA）通路 | — | — | 能量供给 | 表达杂合酵母-细菌MVA途径提供IPP/DMAPP前体 |
| Escherichia coli DH5α | 单萜合成通路 | truncated GPP synthase (trGPPS) | 牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | 催化IPP和DMAPP缩合生成GPP |
| Escherichia coli DH5α | 单萜合成通路 | pinene synthase (PinS) | (-)-α-蒎烯合酶 | 催化 | 催化GPP环化生成α-蒎烯（84%）和β-蒎烯（9%）等 |
| Escherichia coli DH5α | 单萜合成通路 | VAR3-PinS | 松烯合酶变体VAR3 | 催化 | 突变模板，产生线性、单环和双环产物的等比例混合物 |
| Escherichia coli | — | — | — | 区室化 | 利用dodecane有机覆盖层进行两相培养，原位萃取挥发性单萜产物 |
关键发现
- 筛选了约1000个菌落，鉴定出超过65个独特序列
- 在摇瓶放大验证中，67个变体具有详细产物谱，占所搜索序列空间的40%
- 位置335（区域1）和557、559、560、561（区域3）具有最高可塑性
- 位置445和446任意突变均导致酶失活
- 区域2突变主要产生线性产物（如香叶醇），表明其参与碳正离子异构化/环化
- NBT密码子中Gly和Cys出现频率最高（14.0%和17.7%），Pro和Arg最低（2.2%和0.8%）
- 变体C335A、C335G、A557S、M559C/T/V、A560C、F562P/L在初始筛选中峰强度最高。
研究结论
该自动化筛选流程能有效富集具有改变产物谱的活性萜烯合酶变体，与摇瓶培养结果吻合；揭示了松烯合酶三个可塑性区域在环化级联中的作用，区域1和3高度可塑，区域2对碳正离子环化至关重要。