A Novel Epimerase That Converts GlcNAc-P-P-undecaprenol to GalNAc-P-P-undecaprenol in Escherichia coli O157
- 作者
- Jeffrey S. Rush, Cristina Alaimo, Riccardo Robbiani, Michael Wacker, Charles J. Waechter
- 单位
- Department of Molecular and Cellular Biochemistry, University of Kentucky College of Medicine, Lexington, Kentucky 40536; GlycoVaxyn AG, Grabenstrasse 3, 8952 Schlieren, Switzerland
- 杂志
- Journal of Biological Chemistry（2010）
- DOI
- 10.1074/jbc.M109.061630
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阐明大肠杆菌O157中O抗原重复单元四糖生物合成的起始步骤，尤其是GalNAc-P-P-undecaprenol的生成机制；验证WecA是否直接利用UDP-GalNAc，并发现新的表异构酶。
研究策略
通过膜制剂酶活测定、放射性标记底物、代谢标记、基因克隆与异源表达、体外脂质中间体互变实验、UMP逆转实验及C. jejuni N-糖基化报告系统等，鉴定催化GlcNAc-P-P-Und异构化为GalNAc-P-P-Und的酶。
核心内容
本研究以大肠杆菌O157的O抗原四糖重复单元生物合成为对象，旨在阐明起始脂质中间体GalNAc-P-P-undecaprenol的生成机制。通过膜制剂酶活测定、放射性标记底物、代谢标记及异源表达等实验，发现WecA并不能直接利用UDP-GalNAc转移GalNAc-P，膜制剂中检测不到UDP-[³H]GalNAc标记的糖脂产物（<0.01）；相反，O157膜能将外源[³H]GlcNAc-P-P-Und可逆地异构化为[³H]GalNAc-P-P-Und。研究首次鉴定了一种新型GlcNAc-P-P-undecaprenol 4-表异构酶（Z3206），其催化GlcNAc-P-P-Und与GalNAc-P-P-Und间的可逆互变，质谱确认产物m/z 1128与GalNAc-P-P-Und一致，且Z3206无UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc 4-表异构酶活性。该酶在含还原端GalNAc的22株大肠杆菌中存在于16株，而在不含GalNAc菌株中仅4株检出，提示其分布与O抗原结构相关。该发现修正了WecA底物特异性的既有假设，揭示了O抗原起始步骤的新调控节点，并提示Z3206可作为抗菌药物开发的潜在靶点。
创新点
首次发现并鉴定了一种新型GlcNAc-P-P-undecaprenol 4-表异构酶（Z3206），证明GalNAc-P-P-Und由GlcNAc-P-P-Und可逆异构化生成，而非WecA直接转移GalNAc-P；修正了此前关于WecA底物特异性的假设；提示该酶可作为抗菌药物靶点。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli O157 | O抗原重复单元组装 | Z3206 | GlcNAc-P-P-undecaprenol 4-epimerase (Z3206) | 催化 | 催化GlcNAc-P-P-Und可逆异构化为GalNAc-P-P-Und；与O55/O86的gne/gne1同源 |
| Escherichia coli (K12, PR4019, O157, 21546) | O抗原/肠杆菌共同抗原合成 | wecA | WecA (GlcNAc-phosphotransferase) | 催化 | 将GlcNAc-P从UDP-GlcNAc转移至Und-P；不利用UDP-GalNAc |
| Escherichia coli DH5α | 蛋白质N-糖基化报告系统（C. jejuni pgl） | gne | Gne (UDP-Glc/UDP-GlcNAc 4-epimerase) | 催化 | 用于互补Δgne，Z3206不能替代其功能 |
| Campylobacter jejuni | N-糖基化途径 | pgl cluster (含gne) | Pgl糖基化酶系 | 催化 | 为体内报告系统，用于评估Z3206是否具有UDP-GlcNAc 4-表异构酶活性 |
关键发现
- ['膜制剂实验中，K12、PR4019、O157均不能利用UDP-[3H]GalNAc形成标记糖脂（<0.01）；而用UDP-[3H]GlcNAc时，10分钟内K12产生GlcNAc-P-P-Und
- 4，PR4019产生44，O157产生GlcNAc-P-P-Und
- 5和GalNAc-P-P-Und
- 5（数值见表2）。', 'O157膜能将外源[3H]GlcNAc-P-P-Und转变为[3H]GalNAc-P-P-Und，也能将[3H]GalNAc-P-P-Und转回[3H]GlcNAc-P-P-Und（图7）。', '代谢标记实验中，表达Z3206的21546菌株与[3H]GlcNAc孵育后产生GalNAc-P-P-Und，而亲本21546仅产生GlcNAc-P-P-Und（图4）。', 'Z3206不能互补C. jejuni pgl Δgne系统中的AcrA糖基化，说明其没有UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc 4-表异构酶活性（图8）。', '纯化的GalNAc-P-P-Und的[M-H]-为m/z 1128，MS/MS碎片为m/z 907，与GalNAc-P-P-Und一致。', 'Z3206与E. coli O55/O86的gne/gne1基因100%同一性，与S. boydii O18 88%、S. enterica O30 94%；在62株E. coli中，Z3206存在于22株含还原端GalNAc菌株中的16株，而40株不含GalNAc菌株中仅4株。', 'Z3206预测为37 kDa可溶蛋白，但与膜部分相关，含Rossman fold GXXGXXG和SX24YX3K基序。']
研究结论
在E. coli O157中，O抗原起始脂质中间体GalNAc-P-P-Und是通过新型GlcNAc-P-P-Und 4-表异构酶（Z3206）催化GlcNAc-P-P-Und可逆差向异构化生成的，WecA不利用UDP-GalNAc；该途径可能成为抗菌药物干预的靶点。