ESTABLISHMENT OF SALMONELLA STRAIN EXPRESSING CATALYTICALLY ACTIVE HUMAN UDP-GLUCURONOSYLTRANSFERASE 1A1 (UGT1A1)
- 作者
- Ken-ichi Fujita, Akiko Mogami, Akemi Hayashi, Tetsuya Kamataki
- 单位
- Laboratory of Drug Metabolism, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University, Sapporo 060-0812, Japan
- 杂志
- Life Sciences（2000）
- DOI
- 10.1016/s0024-3205(00)00521-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在细菌中实现人UDP-葡萄糖醛酸转移酶1A1 (UGT1A1) 的活性表达。之前在大肠杆菌中表达UGT蛋白无法检测到催化活性，推测是由于大肠杆菌内源β-葡萄糖醛酸苷酶分解了葡萄糖醛酸结合产物。
研究策略
将人UGT1A1 cDNA克隆到pSE420质粒（含trc启动子），转化至沙门氏菌TA1535中表达，并在活性检测中加入β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂（如葡萄糖二酸1,4-内酯）以抑制内源β-葡萄糖醛酸苷酶活性，从而检测UGT1A1催化胆红素葡萄糖醛酸化的活性。
核心内容
研究人员将人UDP-葡萄糖醛酸转移酶1A1（UGT1A1）cDNA克隆至含trc启动子的pSE420质粒，转化沙门氏菌TA1535，首次在细菌中实现该类蛋白的活性表达，无需纯化和膜重构。IPTG诱导24小时表达量最高，但直接检测胆红素葡萄糖醛酸化产物活性不可得；加入9.6 μM葡萄糖二酸1,4-内酯抑制宿主内源β-葡萄糖醛酸苷酶后，最大活性达79 pmol/min/mg蛋白，约为肝微粒体活性（199 pmol/min/mg蛋白）的40%。甘草酸与1-萘基-β-D-葡萄糖醛酸同样可保护产物但效果较弱；对硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸仅在浓度高于1.6 mM时测得5.7 pmol/min/mg蛋白。沙门氏菌水解黄苓苷为去葡萄糖醛酸产物的速率达73 nmol/min/mg蛋白，但对硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸的β-葡萄糖醛酸苷酶背景活性显著低于大肠杆菌DH5α。结果表明沙门氏菌内源水解活性较弱，更适合作为UGT蛋白的功能表达宿主，为后续人源糖基转移酶在细菌体系中的表征提供了可操作平台。
创新点
首次在细菌中表达出具有催化活性的人UGT蛋白（无需纯化和重构）；发现沙门氏菌TA1535存在低水平β-葡萄糖醛酸苷酶，通过抑制剂成功检测到活性；证明沙门氏菌比大肠杆菌更适合作为UGT蛋白的表达宿主。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Salmonella typhimurium TA1535 | 葡萄糖醛酸化 | UGT1A1 | 人UDP-葡萄糖醛酸转移酶1A1 | 催化 | 异源表达，催化胆红素与葡萄糖醛酸结合 |
| Salmonella typhimurium TA1535 | 葡萄糖醛酸水解 | — | β-葡萄糖醛酸苷酶 | 催化 | 内源性酶，水解葡萄糖醛酸结合物，使用抑制剂后可检测UGT活性 |
| Escherichia coli DH5α | 葡萄糖醛酸水解 | — | β-葡萄糖醛酸苷酶 | 催化 | 对照菌株，β-葡萄糖醛酸苷酶活性高于沙门氏菌 |
关键发现
- 人UGT1A1在沙门氏菌TA1535中成功表达，IPTG诱导后24小时表达量最高
- 未加β-葡萄糖醛酸苷酶抑制剂时胆红素结合活性不可检测，加入9.6 μM葡萄糖二酸1,4-内酯后最大活性为79 pmol/min/mg蛋白
- 人肝微粒体中的胆红素结合活性为199 pmol/min/mg蛋白
- 甘草酸和1-萘基-β-D-葡萄糖醛酸也能产生活性，但效果低于葡萄糖二酸1,4-内酯
- 对硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸在浓度高于1.6 mM时活性为5.7 pmol/min/mg蛋白
- 沙门氏菌中黄苓苷去葡萄糖醛酸活性为73 nmol/min/mg蛋白（80 μM黄苓苷）
- 沙门氏菌对硝基苯基-β-D-葡萄糖醛酸的β-葡萄糖醛酸苷酶活性远低于大肠杆菌DH5α。
研究结论
成功建立了表达具有催化活性的人UGT1A1的沙门氏菌菌株；沙门氏菌的β-葡萄糖醛酸苷酶活性低于大肠杆菌，因此沙门氏菌是表达UGT蛋白的良好宿主。