Affinity-Capture Tandem Mass Spectrometric Characterization of Polyprenyl-Linked Oligosaccharides: Tool to Study Protein N-Glycosylation Pathways
- 作者
- Christopher W. Reid, Jacek Stupak, Mark M. Chen, Barbara Imperiali, Jianjun Li, Christine M. Szymanski
- 单位
- National Research Council, Institute for Biological Sciences, 100 Sussex Drive, Ottawa, ON, Canada, K1A 0R6; Department of Chemistry and Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, 77 Massachusetts Avenue, Cambridge, Massachusetts 02139
- 杂志
- Analytical Chemistry（2008）
- DOI
- 10.1021/ac800079r
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
现有分析脂质连接寡糖（LLO）的方法依赖放射性标记和色谱分离，难以快速、准确地提供结构信息。需要开发一种免放射性标记、能直接检测和表征 LLO 的新方法，以研究原核和真核 N-糖基化途径。
研究策略
利用大豆凝集素（SBA）亲和捕获富集 LLO，结合毛细管电泳-质谱（CE-MS）进行检测和结构表征，并应用于 C. jejuni 和工程大肠杆菌的 N-糖基化途径分析。
核心内容
本研究开发了一种基于大豆凝集素亲和捕获与毛细管电泳-质谱联用的新方法，用于免放射性标记地直接检测和表征脂质连接寡糖，并应用于空肠弯曲菌和工程大肠杆菌的N-糖基化途径分析。该方法对纯化的十一异戊烯焦磷酸-庚糖检测限达亚皮摩尔级，且凝集素能结合至少含一个GalNAc残基的二糖LLO。在空肠弯曲菌野生型中未检测到LLO，而pglB和pglK突变体积累Und-PP-庚糖，pglJ突变体则积累UDP-Bac2,4diNAc；在工程大肠杆菌DH5α中，多种LLO中间体被检出，其中天然N-多糖占总LLO池不足10%，主要中间体为6HexNAc+1Hex，而SCM7菌株仅积累含Bac2,4diNAc的庚糖LLO。结果表明空肠弯曲菌N-糖基化途径受严格反馈调控，可能存在辅助蛋白参与，而大肠杆菌糖工厂中该途径调控松散。该技术为研究原核和真核糖缀合物生物合成途径提供了通用分析工具。
创新点
首次提出基于凝集素亲和捕获与 CE-MS 联用的策略，无需放射性标记和色谱分离即可直接检测并解析完整脂质连接寡糖的结构信息；成功用于细菌 N-糖基化途径的中间体分析，并揭示了 C. jejuni 和 E. coli 中途径调控的差异。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Campylobacter jejuni 11168 | N-糖基化途径 (Pgl) | — | — | — | 野生型和 pgl 突变株研究对象 |
| Escherichia coli DH5α | N-糖基化途径 (Pgl) | pgl operon | — | — | 携带 pACYCpgl 或 pACYCpglmut 的糖工厂 |
| Escherichia coli SCM7 | N-糖基化途径 (Pgl) | pgl operon | — | — | 缺失 Wzx 家族翻转酶和 WecA 的菌株 |
| — | N-糖基化途径 (Pgl) | pglB | PglB | 催化 | 寡糖转移酶，将聚糖转移到天冬酰胺残基 |
| — | N-糖基化途径 (Pgl) | pglD | PglD | 催化 | Bac2,4diNAc 乙酰转移酶 |
| — | N-糖基化途径 (Pgl) | pglH | PglH | 催化 | 加工性 GalNAc 转移酶 |
| — | N-糖基化途径 (Pgl) | pglI | PglI | 催化 | 葡萄糖转移酶 |
| — | N-糖基化途径 (Pgl) | pglJ | PglJ | 催化 | 第二个 GalNAc 转移酶 |
| — | N-糖基化途径 (Pgl) | pglK | PglK | 转运 | 翻转酶 (flippase)，将脂质连接聚糖翻转至周质 |
关键发现
- 该方法对纯化的 Und-PP-庚糖检测限达亚皮摩尔级
- SBA 凝集素能结合至少含一个 GalNAc 残基的二糖 LLO。在 C. jejuni 野生型中未检测到 LLO，而 pglB 和 pglK 突变体中检测到 Und-PP-庚糖（m/z 1166.0）
- pglH、pglI、pglJ、pglD 突变体无 LLO 积累，且 pglJ 突变体积累 UDP-Bac2,4diNAc。在 E. coli DH5α 中，pACYCpglmut 积累多种 LLO，其中天然 N-多糖（含 Bac2,4diNAc）占总 LLO 池不足 10%，主要中间体为 6HexNAc+1Hex（相对强度 100%）
- 在 E. coli SCM7 中仅检测到含 Bac2,4diNAc 的庚糖 LLO。
研究结论
开发了一种基于凝集素亲和捕获和 CE-MS 的免放射性标记方法，可直接检测和表征生物样品中的完整脂质连接寡糖并获取结构信息。该方法揭示了 C. jejuni N-糖基化途径受到严格调控（存在反馈抑制），而 E. coli 糖工厂中该途径调控松散，提示 C. jejuni 中存在辅助蛋白参与调控。该技术可推广至其他糖缀合物生物合成途径研究。