Identification of an alternative translation initiation site for the Pantoea ananatis lycopene cyclase (crtY) gene in E. coli and its evolutionary conservation
- 作者
- Sung-Woo Kim, Woo-Hyuk Jung, Ji-Myung Ryu, Jae-Bum Kim, Hyung-Wook Jang, Young-Bae Jo, Joon-Ki Jung, Jung-Hoe Kim
- 单位
- AceBiotech Co., Ltd., #114 Bio-Venture Center, KRIBB, Yuseong, Daejeon 305-806, Republic of Korea; Division of Biotechnology R&BD, KRIBB, Yuseong, Daejeon 305-806, Republic of Korea; Department of Biological Sciences, KAIST, Yuseong, Daejeon 305-701, Republic of Korea
- 杂志
- Protein Expression and Purification（2007）
- DOI
- 10.1016/j.pep.2007.11.004
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
研究 Pantoea ananatis 番茄红素环化酶编码基因 crtY 在大肠杆菌中的非 ATG 替代翻译起始位点，并探讨其进化保守性。
研究策略
通过定点突变构建多种 crtY 突变体（替换 ATG、引入终止密码子、替换假定起始密码子等），与番茄红素合成基因（crtE, crtI, crtB）共表达于大肠杆菌，利用 HPLC 分析类胡萝卜素产物及产量，并通过氨基酸序列比对评估替代起始位点的保守性。
核心内容
本研究通过定点突变和共表达策略，在大肠杆菌中系统解析了Pantoea ananatis番茄红素环化酶基因crtY的翻译起始机制。实验构建了多种突变体，包括替换ATG起始密码子、引入终止密码子以及替换假定起始密码子等，并与crtE、crtI、crtB共表达，利用HPLC分析类胡萝卜素产量。结果首次发现crtY内部第10位缬氨酸对应的GTG可作为替代翻译起始密码子，将其替换为GTA仍保留弱活性，而替换为TTG则完全丧失环化功能。携带正常crtY的菌株产β-胡萝卜素1.3 mg/g DCW，而仅在GTG处引入终止密码子的突变体仍能产生0.6 mg/g β-胡萝卜素，表明该位点确实发挥起始功能。不可翻译的crtY突变体使番茄红素产量较对照提高约2倍。氨基酸序列比对显示该替代起始位点在多种微生物中保守，且N-末端9个氨基酸对环化活性无显著影响。该发现揭示了翻译重起始机制可能通过调节环化酶表达水平来影响β-胡萝卜素与番茄红素的比例，为类胡萝卜素代谢工程的精细调控提供了新思路。
创新点
首次发现 crtY 内部 GTG（Val10）可作为替代翻译起始密码子；证明 GTA 也可作为弱起始密码子；提出保守的 Asp 残基可能作为 Shine-Dalgarno 序列一部分参与核糖体结合，且该替代翻译机制在多种微生物中进化保守。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | 类胡萝卜素生物合成 | crtY | Lycopene cyclase | 催化 | 研究的靶标基因，鉴定到内部 GTG(Val10) 替代起始密码子，催化番茄红素转化为 β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli DH5α | 类胡萝卜素生物合成 | crtE, crtI, crtB | — | 催化 | 参与番茄红素合成的上游基因（crtE: GGPP 合酶，crtB: 八氢番茄红素合酶，crtI: 八氢番茄红素脱氢酶） |
关键发现
- 在 E. coli 中，P. ananatis crtY 的翻译起始不依赖 ATG，内部 Val10 (GTG) 可作为替代起始密码子；将 GTG 替换为 GTA 后仍保留弱活性，替换为 TTG 则失去环化功能。类胡萝卜素产量：pTB-EIBY 产 β-胡萝卜素
- 3±0.1 mg/g DCW；pTB-EIBY(M1) 为
- 2±0.2；pTB-EIBY(M1M2) 为
- 8±0.3；pTB-EIBYstop1 为 β-胡萝卜素
- 6±0.1、番茄红素<0.1；pTB-EIBYstop2 只产番茄红素
- 7±0.1；pTB-EIBYstop13 产番茄红素
- 8±0.2、β-胡萝卜素<0.1；pTB-EIBY(V) 产番茄红素
- 6±0.1、β-胡萝卜素
- 3±0.1；pTB-EIBY(L) 只产番茄红素
- 8±0.1。与 pTB-EIB 的番茄红素产量（平均
- 45 mg/g DCW）相比，不可翻译的 crtY 突变体使番茄红素产量提高约 2 倍。N-末端 9 个氨基酸对环化活性无显著影响。
研究结论
本研究鉴定到 crtY 基因中一个内部 GTG 替代翻译起始位点，该位点在多种微生物的番茄红素环化酶中保守，且 GTA 也可作为弱起始密码子。此机制可能通过翻译重起始调节环化酶表达水平，从而影响 β-胡萝卜素/番茄红素比例。