Isolation of Schizosaccharomyces pombe Isopentenyl Diphosphate Isomerase cDNA Clones by Complementation and Synthesis of the Enzyme in Escherichia coli
- 作者
- Frederick M. Hahn, C. Dale Poulter
- 单位
- Department of Chemistry, University of Utah
- 杂志
- Journal of Biological Chemistry（1995）
- DOI
- 10.1074/jbc.270.19.11298
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从粟酒裂殖酵母中分离编码异戊烯基二磷酸异构酶（IPP isomerase）的cDNA，并实现该酶在大肠杆菌中的异源合成，以用于比较研究和序列分析。
研究策略
利用质粒穿梭（plasmid shuffle）技术，通过酿酒酵母IDI1基因缺失突变株的互补筛选，从粟酒裂殖酵母cDNA表达文库中分离靶标基因，再在大肠杆菌中表达纯化重组酶。
核心内容
本研究通过质粒穿梭互补策略，从粟酒裂殖酵母cDNA表达文库中分离了编码异戊烯基二磷酸异构酶的cDNA。利用酿酒酵母IDI1基因缺失突变株进行功能互补筛选，从约40,000个转化子中获得23个存活克隆，其中4个确认为粟酒裂殖酵母idi1基因。该基因编码227个氨基酸的蛋白，预测分子量26,864道尔顿，比酿酒酵母酶少52个N端氨基酸。重组酶在大肠杆菌中成功表达并纯化至95%以上纯度，比活为20 units/mg，与酿酒酵母酶相当。序列比对显示催化必需的Cys和Glu残基在粟酒裂殖酵母（Cys87、Glu152）、酿酒酵母（Cys139、Glu207）及人类同源蛋白中均保守。此外，截去N端45个氨基酸的酿酒酵母酶在大肠杆菌中仍保持5倍于对照的活性，并能互补IDI1缺失突变。结果表明质粒穿梭策略可广泛用于异源IPP异构酶基因的功能筛选，且该类酶N端区域并非催化活性所必需，为异戊二烯生物合成途径的酶学比较与改造提供了新视角。
创新点
首次通过互补策略克隆粟酒裂殖酵母IPP异构酶cDNA；发现其编码蛋白比酿酒酵母酶少52个N端氨基酸但保持催化活性；证实质粒穿梭技术适用于筛选异源IPP异构酶基因。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae FH2-5b | 异戊二烯生物合成途径 | IDI1 | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 宿主菌株用于cDNA文库互补筛选，染色体IDI1被LEU2破坏，由pRS317:IDI1维持 |
| Schizosaccharomyces pombe | 异戊二烯生物合成途径 | idi1 | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 从cDNA文库中分离，编码227氨基酸蛋白，含活性位点Cys87和Glu152 |
| Escherichia coli JM101 | 异戊二烯生物合成途径 | S. pombe idi1 | 重组粟酒裂殖酵母异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 通过pARC306N载体表达，纯化后比活20 units/mg |
| Escherichia coli DH5α | — | — | — | — | 用于质粒扩增和克隆操作 |
| Escherichia coli JM101 | 异戊二烯生物合成途径 | IDI1T（截短酿酒酵母IDI1基因） | 截短的酿酒酵母异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 缺失N端45个氨基酸，在E. coli中表达活性为对照5倍，但蛋白主要存在于沉淀中 |
| Saccharomyces cerevisiae FH1 | 异戊二烯生物合成途径 | IDI1T | 截短的异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 二倍体菌株，经孢子分析验证截短基因可互补idi1::leu2破坏 |
关键发现
- 克隆的粟酒裂殖酵母IPP异构酶cDNA编码227个氨基酸的蛋白，预测分子量26,864道尔顿
- 重组酶在大肠杆菌中表达并纯化至95%以上纯度，比活为20 units/mg，与酿酒酵母酶相似
- 截短的酿酒酵母IPP异构酶（缺失N端45个氨基酸）在E. coli中具有5倍于对照的异构酶活性，并能互补酿酒酵母IDI1缺失突变
- 序列比对显示催化必需的Cys和Glu残基在粟酒裂殖酵母（Cys87、Glu152）、酿酒酵母（Cys139、Glu207）和人类同源蛋白中均保守
- 从约40,000个转化子中经α-AA反选择获得23个存活克隆，其中4个为S. pombe IDI1 cDNA。
研究结论
通过质粒穿梭互补策略成功分离了粟酒裂殖酵母IPP异构酶cDNA，其编码蛋白虽比酿酒酵母酶小（缺少N端52个氨基酸）但具有相似的催化活性；该策略可广泛用于从异源文库中筛选功能性IPP异构酶基因。