高级醇 · 代谢工程文献库

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Cyclization mechanism of phomopsene synthase: mass spectrometry based analysis of various site-specifically labeled terpenes

作者
Sandip S Shinde, Atsushi Minami, Zhi Chen, Tetsuo Tokiwano, Tomonobu Toyomasu, Nobuo Kato, Takeshi Sassa, Hideaki Oikawa
杂志
The Journal of Antibiotics（2017）
DOI
10.1038/jia.2017.27
所属领域
合成生物学
关键词
EI-MSchemoenzymatic synthesiscyclization mechanismdeuterium-labeled GGPPphomopsene synthaseterpene cyclase
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解决的核心问题

阐明phomopsene合酶（PaPS）催化二萜环化生成phomopsene的反应机制，为萜烯环化酶的理性工程改造提供基础。

研究策略

采用化学酶法，以四种化学合成的位点特异性氘标记异戊烯基焦磷酸（IPP）为原料，通过IPP异构酶（IDI）和异戊烯基转移酶（IspA-S81F、IspA）合成一组位点特异性氘标记的GGPP，经PaPS催化环化生成标记的phomopsene，再结合EI-MS和MS/MS分析标记产物的碎片质量位移，推断各碎片结构，进而提出环化机制。

研究路线图

100%
研究问题：阐明PaPS催化二萜环化机制
策略：化学酶法合成位点特异的氘标记GGPP
关键改造：IspA-S81F突体+IDI+IspA合成标记GGPP
PaPS催化环化生成标记的phomopsene
EI-MS/MS分析：检测碎片离子位移（~10 ng样品）
结果：证明A环C13-C14断裂及两次1,2-烷基迁移；D环1,2-氢迁移；C6去质子化
结论：提出完整环化机制，建立通用高灵敏分析策略（EI-MS，~10 ng）
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核心内容

本研究以化学酶法合成位点特异性氘标记的异戊烯基焦磷酸（IPP）为切入点，系统阐明了phomopsene合酶（PaPS）催化二萜环化生成phomopsene的详细机制。作者利用四种化学合成的氘标记IPP，经IPP异构酶（IDI）及异戊烯基转移酶（IspA、IspA-S81F）组合，高效制备了多种位点标记的GGPP，再经PaPS催化环化获得标记产物，并结合EI-MS与MS/MS分析碎片质量位移，推断出各碎片结构归属。关键结果方面，该方法仅需约10 ng样品即可完成分析，灵敏度较NMR高逾100倍；通过对标记产物质谱碎片的解析，证实A环构建涉及C13-C14键断裂与两次连续的1,2-烷基迁移，D环则存在1,2-氢迁移且最终去质子化发生在C6。据此提出完整环化机制：GGPP经焦磷酸消除形成dolabelladien-15-yl阳离子，经历两次烷基迁移、一次氢迁移，经C2-C10关环及C6去质子化生成四环产物。该策略为复杂萜类环化机制研究提供了高灵敏度通用工具，有助于萜烯合酶的理性工程改造。

创新点

['建立了从位点特异性氘标记IPP出发，经IPP异构酶和异戊烯基转移酶化学酶法合成多种位点特异性标记的寡异戊烯基焦磷酸（DMAPP、GPP、FPP、GGPP）的高效方法', '利用EI-MS分析位点特异性标记萜烯，所需样品量仅约10 ng，比NMR灵敏度高100倍以上，避免了NMR检测限的限制', '提出了基于[C-2H3]标记前体区分同分异构碎片、结合位点特异标记确定碎片归属的通用分析策略']

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli BL21(DE3) 萜类生物合成 idi IPP异构酶（IDI） 催化 用于将氘标记IPP异构化为DMAPP，以及标记起始单元
Escherichia coli DH5α 萜类生物合成 ispA FPP合酶（IspA） 催化 用于从DMAPP和IPP延伸合成GPP/FPP/GGPP，体外反应中用于快速转化前体
Escherichia coli BL21(DE3) 萜类生物合成 ispA-S81F GPP合酶突变体（IspA-S81F） 催化 定点突变改造的GPP合酶，用于合成GPP
Escherichia coli BL21(DE3) 二萜生物合成（GGPP→phomopsene） paPS phomopsene合酶（PaPS） 催化 双功能萜烯合酶，催化GGPP环化生成四环二萜phomopsene

关键发现

  1. ['EI-MS分析仅需约10 ng样品，灵敏度比NMR高>100倍', '在phomopsene的EI-MS谱中观察到主要碎片离子m/z 257、202、160、145，以及243、216等
  2. MS/MS显示F202→F160→F145→F105的级联碎裂序列', '利用四种位点特异性氘标记GGPP（分别标记异戊二烯单元III和IV等）确定了A环上所有氢原子的来源，证明C13-C14键断裂、两个连续的1,2-烷基迁移参与了A环构建', "D环分析显示异戊二烯单元I的C2烯氢在产物中迁移至C3，证实存在1,2-氢迁移
  3. II-[2'-CD]标记在产物中丢失，表明最终去质子化发生在C6", '提出完整环化机制：GGPP经焦磷酸消除形成dolabelladien-15-yl阳离子，经历两次1,2-烷基迁移、一次1,2-氢迁移，经C2-C10关环及C6去质子化生成四环二萜phomopsene', '基于序列分析的分类显示PaPS属于clade B，与首次环化为C1-III-IV型（5-11环系）的预测一致']

研究结论

本研究开发了一种高效化学酶法合成位点特异性同位素标记的异戊烯基焦磷酸前体，结合EI-MS分析能够充分阐明PaPS的环化机制。该方法高灵敏度、样品需求量小，可推广至复杂萜类的环化机制研究，为萜烯合酶的理性工程改造提供有力工具。