Putidaredoxin Reductase-Putidaredoxin-Cytochrome P450cam Triple Fusion Protein: CONSTRUCTION OF A SELF-SUFFICIENT ESCHERICHIA COLI CATALYTIC SYSTEM
- 作者
- Ole Sibbesen, James J. De Voss, Paul R. Ortiz de Montellano
- 单位
- Department of Pharmaceutical Chemistry, School of Pharmacy, University of California, San Francisco, California 94143-0446
- 杂志
- Journal of Biological Chemistry（1996）
- DOI
- 10.1074/jbc.271.37.22462
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
构建无需外源电子传递蛋白的自足P450cam催化体系，使大肠杆菌能直接催化底物氧化
研究策略
将P450cam、putidaredoxin (Pd)和putidaredoxin还原酶(PdR)的cDNA通过柔性linker按不同顺序融合，在大肠杆菌中表达、纯化并表征，筛选最优融合构型
核心内容
该研究构建了由细胞色素P450cam、putidaredoxin（Pd）和putidaredoxin还原酶（PdR）组成的三重融合蛋白，目的是在大肠杆菌中建立无需外源电子传递蛋白的自足催化体系。研究者将三种蛋白的cDNA通过柔性linker按不同顺序融合，在大肠杆菌中表达纯化并筛选最优构型。结果显示，PdR-Pd-P450cam融合蛋白具有最高催化活性，kcat约为30 min⁻¹，在大肠杆菌中的表达量可达150–200 nmol/L，延长表达时间可提升至600–700 nmol/L。当蛋白浓度低于0.3 μM时，融合蛋白的活性高于等摩尔重组天然体系。完整大肠杆菌细胞表达该融合蛋白后，能将樟脑氧化为5-exo-羟基樟脑和5-氧代樟脑，且O₂消耗与底物氧化紧密偶联。该工作首次证明PdR-Pd-P450cam三重融合蛋白可在细菌中构成异源自足的P450cam催化系统，为利用工程菌进行异生物代谢或精细化学品合成提供了可行方案。
创新点
首次构建并表征可溶性的P450cam-Pd-PdR三组分融合蛋白；证明PdR-Pd-P450cam融合蛋白使大肠杆菌具备自足催化樟脑氧化的能力
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | 樟脑氧化 | — | 细胞色素P450cam (CYP101) | 催化 | 催化樟脑羟基化生成5-exo-羟基樟脑 |
| Escherichia coli DH5α | 樟脑氧化 | — | Putidaredoxin reductase (PdR) | 催化 | NADH依赖的黄素蛋白还原酶，将电子从NADH传递至Pd |
| Escherichia coli DH5α | 樟脑氧化 | — | Putidaredoxin (Pd) | 能量供给 | 铁硫蛋白，作为电子载体将电子从PdR传递至P450cam |
关键发现
- 优化得到的PdR-Pd-P450cam融合蛋白最高催化活性kcat=30 min^-1
- 融合蛋白在E. coli中表达量为150-200 nmol/L，延长表达时间可达600-700 nmol/L
- 当蛋白浓度低于0.3 μM时，融合蛋白活性高于等摩尔(1:1:1)重组的天然体系
- 二元PdR-Pd融合蛋白支持天然P450cam的kcat约为166 min^-1
- PdR-Pd域向细胞色素c的电子传递速率为365 min^-1
- 完整E. coli细胞表达该融合蛋白可将樟脑氧化为5-exo-羟基樟脑和5-氧代樟脑，且O2消耗与底物氧化紧密偶联
研究结论
构建的PdR-Pd-P450cam三重融合蛋白在大肠杆菌中构成首个异源自足的P450cam催化系统，能高效氧化樟脑，展示了构建细菌生物反应器用于异生物代谢或精细化学品合成的可行性