Fusion-type lycopene β-cyclase from a thermoacidophilic archaeon Sulfolobus solfataricus
- 作者
- Hisashi Hemmi, Satoru Ikejiri, Toru Nakayama, Tokuzo Nishino
- 单位
- Department of Biomolecular Engineering, Graduate School of Engineering, Tohoku University
- 杂志
- Biochemical and Biophysical Research Communications（2003）
- DOI
- 10.1016/S0006-291X(03)00798-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
鉴定嗜热嗜酸古菌 Sulfolobus solfataricus 基因组中类胡萝卜素生物合成基因簇内未知基因 SSO2904 的功能，揭示其编码新型融合型番茄红素β-环化酶。
研究策略
利用同源序列分析预测基因功能；构建重组质粒 pUC-ssY 并在产番茄红素的大肠杆菌中进行功能验证；借助 HPLC、LC-MS 分析产物；进行系统发育分析以研究该酶的进化关系。
核心内容
该研究从嗜热嗜酸古菌 Sulfolobus solfataricus 基因组中的类胡萝卜素合成基因簇入手，鉴定了一个未知基因 SSO2904 的功能。通过序列同源分析发现其可能编码番茄红素 β-环化酶，随后构建重组质粒并在产番茄红素的大肠杆菌中异源表达。功能验证中，表达该基因的菌落由红色变为红橙色，HPLC 检测出现与 β-胡萝卜素标准品保留时间一致的新峰，LC-MS 测得分子离子 m/z 537，明确确认产物为 β-胡萝卜素。序列分析显示该酶是融合型蛋白，其 N 端和 C 端分别与细菌异二聚酶的两个亚基 CrtYc、CrtYd 同源，且与真菌 CrtYB 融合蛋白结构不同。系统发育分析表明 type-2 LC 存在两个亚群，其中 CrtYd 区分支自展值达 993，提示古菌与细菌、真菌之间可能存在水平基因转移或趋同进化。该研究首次揭示古菌中存在融合型番茄红素 β-环化酶，为理解类胡萝卜素合成酶的进化路径提供了新证据。
创新点
首次发现古菌中的融合型番茄红素β-环化酶，其N端和C端分别与细菌异二聚酶的两个亚基 CrtYc 和 CrtYd 同源；证实其与真菌 CrtYB（与八氢番茄红素合酶的融合蛋白）结构不同；系统发育分析揭示 type-2 LC 的进化路线比预期复杂，存在两个亚群。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Sulfolobus solfataricus | 类胡萝卜素生物合成 | SSO2904 | 融合型番茄红素β-环化酶（LC） | 催化 | N端与C端分别同源于细菌CrtYc和CrtYd亚基；催化番茄红素两端的β-环化反应生成β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli DH5α | 类胡萝卜素生物合成（异源重组） | pACYC-IBE（含来自Erwinia uredovora的GGPP合酶、八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶基因） | GGPP合酶、八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 用于在大肠杆菌中合成番茄红素，作为SSO2904底物 |
| Sulfolobus solfataricus | 类胡萝卜素生物合成 | SSO2905 | 八氢番茄红素合酶（推测） | 催化 | 基因簇中预测的八氢番茄红素合酶基因 |
| Sulfolobus solfataricus | 类胡萝卜素生物合成 | SSO2906 | β-胡萝卜素羟化酶（推测） | 催化 | 负责将β-胡萝卜素转化为玉米黄质 |
| Sulfolobus solfataricus | 类胡萝卜素生物合成 | SSO2907 | 八氢番茄红素脱氢酶（推测） | 催化 | 催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素 |
| Sulfolobus solfataricus | 类胡萝卜素生物合成 | SSO2903 | 未知 | 调控 | 基因簇中的未知ORF，功能未鉴定 |
关键发现
- 重组表达 SSO2904 后，大肠杆菌细胞中积累 β-胡萝卜素，菌落颜色由红色变为红橙色
- HPLC 显示新峰与标准 β-胡萝卜素保留时间一致，吸收光谱几乎重叠
- LC-MS 测得分子离子 m/z 537，与 β-胡萝卜素分子量相符。此外，系统发育分析显示 type-2 LC 分为两个亚群，其中一个亚群包含 S. solfataricus、Brevibacterium linens 和 Mycobacterium sp.，另一个包含 Halobacterium salinarum、Myxococcus xanthus 和真菌，且 CrtYd 区域的分支自展值为 993（1000次重复）。
研究结论
研究证实 S. solfataricus 的 SSO2904 基因编码一种融合型番茄红素 β-环化酶，属于 type-2 LC，其结构介于细菌异二聚体酶和真菌 CrtYB 融合蛋白之间；进化分析表明 type-2 LC 存在两个独立进化的亚群，提示古菌与细菌、真菌之间可能存在水平基因转移或趋同进化，该酶的发现为理解类胡萝卜素生物合成酶的进化提供了新视角。