Biotransformation of the sesquiterpene (+)-valencene by cytochrome P450cam and P450BM-3
- 作者
- Rebecca J. Sowden, Samina Yasmin, Nicholas H. Rees, Stephen G. Bell, Luet-Lok Wong
- 单位
- Department of Chemistry, Inorganic Chemistry Laboratory, University of Oxford, South Parks Road, Oxford, UK OX1 3QR
- 杂志
- Organic & Biomolecular Chemistry（2005）
- DOI
- 10.1039/b413068e
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
探索利用细胞色素P450cam和P450BM-3对倍半萜(+)-valencene进行生物氧化，以合成高价值香料(+)-nootkatone，并解决野生酶活性低、选择性差及产物抑制等问题。
研究策略
通过定点突变改造P450cam和P450BM-3的活性位点，结合体外酶活测定和全细胞两相反应（正十六烷为有机相），分析产物分布并分离表征主要氧化产物。
核心内容
本研究利用细菌细胞色素P450cam和P450BM-3对倍半萜(+)-valencene进行生物氧化，以合成高价值香料(+)-nootkatone。针对野生酶活性低、选择性差的问题，通过定点突变改造活性位点，结合体外酶活测定与正十六烷两相全细胞反应分析产物分布。结果显示野生型P450cam不能氧化底物，但F87A/Y96F突变体获得C2氧化区域选择性超过85%，NADH周转速率达36 nmol (nmol P450)^-1 min^-1，产物中trans-nootkatol占70%、nootkatone占12%；F87V/Y96F/L244A突变体使nootkatone占比提升至47%。P450BM-3野生型氧化速率为12 min^-1，R47L/Y51F/F87A突变体将氧化速率提升至34 min^-1，偶联效率41.8%。从全细胞反应中分离表征了nootkatol、nootkatone及多种环氧化产物。关键发现是nootkatone不抑制这两种酶，且P450BM-3氧化nootkatone的速率远高于氧化valencene。两相反应可实现2 mM底物完全转化，但P450cam需提高活性，P450BM-3需改善产物选择性，为后续酶工程改造指明方向。
创新点
首次报道P450cam和P450BM-3对(+)-valencene的氧化；通过F87A/Y96F等突变使P450cam获得高区域选择性（C2氧化>85%）；采用正十六烷两相全细胞反应显著提高底物转化率和产物收率；发现nootkatone不抑制这些细菌P450且是P450BM-3的良好底物。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | (+)-valencene生物氧化 | — | P450BM-3（野生型及突变体） | 催化 | 全细胞反应宿主，用于制备(+)-valencene和(+)-nootkatone氧化产物 |
| Pseudomonas putida | 樟脑氧化（天然） | CYP101A1 | P450cam | 催化 | 野生型不能氧化(+)-valencene，但突变体可氧化 |
| — | (+)-valencene氧化 | CYP101A1突变体 | P450cam突变体（如F87A/Y96F、F87V/Y96F/L244A、F87A/Y96F/L244A/V247L） | 催化 | 高区域选择性，C2氧化>85%，最高氧化速率9.7 min^-1 |
| Bacillus megaterium | 脂肪酸氧化（天然） | CYP102A1 | P450BM-3 | 催化 | 野生型氧化(+)-valencene速率约12 min^-1，产物多样 |
| — | (+)-valencene氧化 | CYP102A1突变体 | P450BM-3突变体（R47L/Y51F、R47L/Y51F/F87A、R47L/Y51F/I263A） | 催化 | 活性提高，R47L/Y51F/F87A氧化速率34 min^-1，但选择性仍低 |
| Pseudomonas putida | P450cam电子传递 | putidaredoxin reductase (Pdr) | Putidaredoxin reductase | 能量供给 | 与putidaredoxin一起为P450cam提供电子 |
| Pseudomonas putida | P450cam电子传递 | putidaredoxin (Pdx) | Putidaredoxin | 能量供给 | 电子传递蛋白，介导电子从Pdr到P450cam |
关键发现
- 野生型P450cam不能氧化(+)-valencene，但F87A/Y96F突变体显示NADH周转速率36 nmol (nmol P450)^-1 min^-1，氧化速率7.2 min^-1，偶联效率20%，产物中(+)-trans-nootkatol占70%、(+)-nootkatone占12%
- F87V/Y96F/L244A突变体氧化速率达9.7 min^-1，产物中nootkatone占47%、trans-nootkatol占38%
- F87A/Y96F/L244A/V247L突变体产生86% trans-nootkatol和4% nootkatone。P450BM-3野生型氧化速率为12 min^-1（NADPH速率40 min^-1），偶联效率30.4%
- R47L/Y51F突变体氧化速率30 min^-1，偶联效率65.9%
- R47L/Y51F/F87A突变体NADPH速率82 min^-1，氧化速率34 min^-1，偶联效率41.8%
- R47L/Y51F/I263A活性较低（10 min^-1）。从全细胞反应中分离并表征了cis/trans-nootkatol、nootkatone、cis-(+)-valencene-1,10-epoxide、trans-nootkaton-9-ol和nootkatone-13S,14-epoxide等产物。
研究结论
P450cam突变体对(+)-valencene氧化具有高区域选择性（C2氧化>85%），但总活性较低（最高约10 min^-1）；P450BM-3活性较高（可达34 min^-1）但产物多样性导致选择性差。Nootkatone不抑制这两种P450，且野生型P450BM-3氧化nootkatone的速率（112 min^-1）远高于氧化valencene。两相全细胞反应可实现2 mM valencene的完全转化，但两种酶均需进一步优化：P450cam需提高活性，P450BM-3需改善底物特异性和产物选择性。