Characterization of stable human aromatase expressed in E. coli
- 作者
- Norio Kagawa, Hiroshi Hori, Michael R. Waterman, Shiro Yoshioka
- 单位
- 范德比尔特大学医学院生物化学系，纳什维尔，田纳西州，美国；大阪大学工学研究科生物工程学系，丰中，大阪，日本
- 杂志
- Steroids（2004）
- DOI
- 10.1016/j.steroids.2004.01.002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
人芳香化酶（P450arom/CYP19）因其疏水性和不稳定性，难以在大肠杆菌中高效表达、纯化和进行详细结构与功能研究。
研究策略
将人CYP19的N端跨膜区替换为CYP2C11的N端序列（MARQSFGRGKL），并利用已知多态性将第264位氨基酸分别构建为Cys（NmA264C）和Arg（NmA264R）两种变体；通过共表达分子伴侣GroES/GroEL或添加氯霉素诱导冷应激来增强表达；对纯化的NmA264R进行酶动力学、光学光谱和EPR光谱表征。
核心内容
该研究通过N端跨膜区替换与多位点突变策略，实现了人芳香化酶（P450arom/CYP19）在大肠杆菌中的稳定高效表达与纯化。研究者将CYP19的N端跨膜序列替换为CYP2C11的对应序列，并构建了第264位分别为Cys和Arg的两种变体，同时借助共表达GroES/GroEL分子伴侣或氯霉素诱导冷应激增强蛋白产量。结果显示，含Arg的NmA264R变体表达量达到约350–400 nmol/L培养物，且约14%分布于细胞质，显著改善了蛋白的亲水性和稳定性。纯化后的NmA264R比含量为13.4 nmol P450/mg蛋白，纯度约73%，对雄烯二酮的Km为0.26 μM，Vmax为12.4 nmol/(min·nmol P450)。光谱分析显示底物游离型Soret峰位于417 nm，与雄烯二酮结合后移至395 nm并出现645 nm电荷转移带；EPR光谱揭示底物结合态具有高达31.3%的菱形度，明显高于P450cam（23.9%）等细胞色素P450酶，为芳香化酶独特的底物结合机制提供了光谱学证据。该工作首次获得了无底物结合的稳定人P450arom样品，为深入解析其结构-功能关系及抑制剂开发奠定了重要工具基础。
创新点
1）发现264位Arg取代Cys使P450arom在大肠杆菌中的表达水平和稳定性显著提升，且约14%的NmA264R出现在细胞质中，提高了亲水性；2）首次实现了在无底物条件下纯化稳定的底物游离型人P450arom，可进行光学和EPR研究；3）揭示了底物结合后较高的菱形度（31.3%和31.0%），为芳香化酶独特机制提供了光谱证据。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | 雌激素生物合成（雄激素芳香化） | CYP19 (突变体NmA264R) | P450arom（人芳香化酶/CYP19） | 催化 | N端前46个氨基酸替换为CYP2C11来源的MARQSFGRGKL，第264位为Arg |
| Escherichia coli DH5α | 分子伴侣系统 | groES/groEL | GroES/GroEL | 调控 | 共表达促进NmA264R正确折叠，显著提高表达量 |
| Escherichia coli | 电子传递链 | CPR | NADPH-P450还原酶（大鼠） | 能量供给 | 在芳香化酶活性测定中提供电子 |
| Escherichia coli | N端替换序列 | CYP2C11 (部分序列) | CYP2C11 N端序列 (MARQSFGRGKL) | 区室化 | 替换人CYP19前46个氨基酸，影响膜结合和表达 |
关键发现
- NmA264R在大肠杆菌中表达量约350-400 nmol/L培养物（共表达GroES/GroEL），NmA264C在氯霉素诱导下约240 nmol/L
- NmA264R中约14±6%分布在细胞质，86±6%在膜组分
- 纯化的NmA264R比含量为13.4 nmol P450/mg蛋白，纯度约73%
- 对雄烯二酮：Km=0.26±0.03 μM，Vmax=12.4±0.2 nmol/(min nmol P450)
- 对睾酮：Km=10.9±2.4 μM，Vmax=52.2±8.8 nmol/(min nmol P450)
- 底物游离型Soret峰417 nm，加雄烯二酮后移至395 nm并出现645 nm电荷转移带
- 雄烯二酮结合Kd=0.86±0.04 μM，ΔAmax(389-421)=73±3
- 睾酮结合Kd=2.7±0.03 μM，ΔAmax(386-420)=36±2
- EPR显示底物结合后g_x=8.34，g_y=3.34，g_z=1.63（雄烯二酮），g_x=8.33，g_y=3.37，g_z=1.63（睾酮），菱形度分别为31.3%和31.0%，高于P450cam(23.9%)、P450scc(27.0%)、P450c21(28.3%)
- 还原CO差光谱峰449 nm，无420 nm肩峰。
研究结论
通过N端替换和264位Arg突变获得了稳定、高效表达的NmA264R变体，可纯化至较高纯度并用于详细的酶学与光谱分析，为研究人芳香化酶的结构-功能关系和抑制剂开发提供了有力工具。