Purification and characterization of recombinant human farnesyl diphosphate synthase expressed in Escherichia coli
- 作者
- Victor D.-H. Ding, Bradley T. Sheares, James D. Bergstrom, Mitree M. Ponpipom, Lawrence B. Perez, C. Dale Poulter
- 单位
- Merck Sharp & Dohme Research Laboratories, Rahway, NJ 07065, U.S.A.; Department of Chemistry, University of Utah, Salt Lake City, UT 84112, U.S.A.
- 杂志
- Biochemical Journal（1991）
- DOI
- 10.1042/bj2750061
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
人法尼基二磷酸（FPP）合酶在天然肝组织中含量低且难以大量获得，限制了对其机理、结构和抑制剂的研究。
研究策略
将人胎儿肝cDNA hpt807编码的FPP合酶与β-半乳糖苷酶前6个氨基酸融合，在大肠杆菌中表达；通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换层析和羟磷灰石层析两步色谱纯化至均一，并进行分子量、动力学及抑制等表征。
核心内容
为获得足量人法尼基二磷酸（FPP）合酶以开展机理与抑制剂研究，该工作将人胎儿肝cDNA编码的FPP合酶与β-半乳糖苷酶前六个氨基酸融合后在大肠杆菌中表达。通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换和羟磷灰石层析两步色谱，从149 mg粗提物纯化得到1.8 mg均一重组蛋白，总回收率64%，纯化倍数52倍。SDS/PAGE显示亚基分子量39 kDa，凝胶过滤测得天然形式约78–80 kDa，表明活性形式为二聚体。该融合蛋白对异戊烯基焦磷酸（IPP）和香叶基焦磷酸（GPP）的Km分别为0.55±0.17 μM和0.43±0.32 μM，Vmax为1.08±0.24 μmol/min/mg。双底物类似物3-甲基-6-亚甲基-2-辛烯-1,8-二基双二磷酸对其IC50为4 μM，显著低于部分纯化人肝酶的50 μM。该重组蛋白的物理和催化性质与天然酶基本一致，表明两步层析即可便捷制备大量均一酶源，为后续结构解析和抑制剂筛选提供了可靠材料。
创新点
建立了高效的两步色谱纯化方案，可便捷地制备大量均一的重组人FPP合酶融合蛋白，并证明了该融合蛋白的物理和催化性质与天然人肝酶几乎一致，为后续机制与抑制剂研究提供了充足酶源。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5αFIQ | 类异戊二烯/胆固醇生物合成 | 人FPP合酶cDNA（hpt807） | 人FPP合酶融合蛋白（含β-半乳糖苷酶前6个氨基酸） | 催化 | 在大肠杆菌中重组表达并纯化至均一，SDS/PAGE单一条带39 kDa，天然分子量约78-80 kDa，呈二聚体 |
关键发现
- 从149 mg粗提物中纯化得到1.8 mg均一重组人FPP合酶融合蛋白，总回收率64%，纯化倍数52倍
- SDS/PAGE显示亚基分子量为39 kDa，凝胶过滤测得天然形式分子量约78-80 kDa，表明活性形式为二聚体
- 对IPP和GPP的Km分别为0.55±0.17 μM和0.43±0.32 μM，Vmax为1.08±0.24 μmol/min/mg
- 双底物类似物3-甲基-6-亚甲基-2-辛烯-1,8-二基双二磷酸对融合蛋白的IC50为4 μM，而部分纯化的人肝酶为50 μM（在5 mM KF存在下降至23 μM），且融合蛋白仅显示少量更高的异戊烯转移酶活性。
研究结论
重组人FPP合酶融合蛋白经两步层析即可纯化至表观均一，产量可观，其结构（二聚体）和催化性质（Km、Vmax、底物抑制及抑制剂响应）与天然人肝FPP合酶基本一致，可用于大规模机制、结构和抑制研究。