Metabolic engineering of Escherichia coli for \(\alpha\) -farnesene production
- 作者
- Chonglong Wang, Sang-Hwal Yoon, Hui-Jeong Jang, Young-Ryun Chung, Jae-Yean Kim, Eui-Sung Choi, Seon-Won Kim
- 单位
- Division of Applied Life Science (BK21 Program), EB-NCRC and PMBBRC, Gyeongsang National University, Jinju 660-701, Republic of Korea; Industrial Biotechnology Research Center, KRIBB, Daejeon 305-806, Republic of Korea
- 杂志
- Metabolic Engineering（2011）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2011.08.001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌中α-法尼烯产量低，主要受限于植物倍半萜合酶异源表达差以及FPP前体供应不足。
研究策略
采用密码子优化α-法尼烯合酶基因、引入外源MVA途径增强IPP和DMAPP供应、过表达FPP合酶（IspA）以及将FPP合酶与α-法尼烯合酶进行蛋白质融合，实现底物通道和代谢通量重定向。
核心内容
该研究以大肠杆菌为宿主，通过组合多种代谢工程策略实现α-法尼烯的高水平生产。针对异源植物倍半萜合酶表达差和法尼基焦磷酸（FPP）前体供应不足两大瓶颈，作者对苹果α-法尼烯合酶基因进行密码子优化，引入外源甲羟戊酸（MVA）途径增强异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）供给，过表达内源FPP合酶（IspA），并将IspA与α-法尼烯合酶通过(GGGGS)2连接肽构建融合蛋白以实现底物通道效应。在2YT培养基含3.0%甘油和0.1 mM IPTG条件下培养48小时，最终工程菌株E. coli ispALaFS-NA的α-法尼烯产量达380.0 mg/L，较初始菌株的1.2 mg/L提高约317倍。密码子优化使产量提升1.3倍，过表达dxs和idi分别提升1.6倍和5.2倍，引入MVA途径后产量达17.8 mg/L，共表达ispA后达57.6 mg/L，融合蛋白策略在添加15 mM甲羟戊酸时达153.6 mg/L，且完全消除法尼醇副产物。在4.0%甘油条件下α-法尼烯得率为18.4 mg/g甘油。该研究证明密码子优化、前体途径强化和蛋白融合的组合策略可有效实现萜类化合物在大肠杆菌中的高效合成，但甲羟戊酸积累表明MVA途径下游仍存在瓶颈，需进一步优化以提高碳流向目标产物的转化效率。
创新点
对苹果α-法尼烯合酶进行密码子优化；利用外源MVA途径显著提高前体供应；构建IspA与α-法尼烯合酶的融合蛋白（含(GGGGS)2连接肽），减少FPP中间体流失并消除FOH副产物。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | MEP途径 | dxs | DXS (1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶) | 催化 | MEP途径限速酶，过表达提高IPP/DMAPP供应 |
| Escherichia coli DH5α | MEP途径 | idi | IDI (异戊烯基焦磷酸异构酶) | 催化 | 催化IPP和DMAPP相互转化，过表达使α-法尼烯产量提高5.2倍 |
| Escherichia coli DH5α | FPP合成 | ispA | IspA (FPP合酶) | 催化 | 催化DMAPP和IPP缩合生成FPP，共表达提高FPP供应 |
| Escherichia coli DH5α | α-法尼烯合成 | aFS | α-法尼烯合酶（密码子优化） | 催化 | 来源于苹果，密码子优化后表达和产量提高 |
| Escherichia coli DH5α | MVA途径（外源） | mvaK1 | 甲羟戊酸激酶（来自肺炎链球菌） | 催化 | MVA途径下游酶，催化甲羟戊酸磷酸化 |
| Escherichia coli DH5α | MVA途径（外源） | mvaK2 | 磷酸甲羟戊酸激酶（来自肺炎链球菌） | 催化 | 催化磷酸甲羟戊酸进一步磷酸化 |
| Escherichia coli DH5α | MVA途径（外源） | mvaD | 二磷酸甲羟戊酸脱羧酶（来自肺炎链球菌） | 催化 | 催化二磷酸甲羟戊酸脱羧生成IPP |
| Escherichia coli DH5α | MVA途径（外源） | mvaE | 乙酰乙酰CoA硫解酶/HMG-CoA还原酶（来自粪肠球菌） | 催化 | 双功能酶，催化乙酰乙酰CoA生成和HMG-CoA还原 |
| Escherichia coli DH5α | MVA途径（外源） | mvaS | HMG-CoA合酶（来自粪肠球菌） | 催化 | 催化乙酰乙酰CoA与乙酰CoA缩合生成HMG-CoA |
| Escherichia coli DH5α | α-法尼烯合成 | ispA-aFS (融合基因) | IspA-(GGGGS)2-α-farnesene synthase 融合蛋白 | 催化 | FPP合酶与α-法尼烯合酶融合，实现底物通道，减少FPP流失，无FOH副产物 |
关键发现
- 最终工程菌株E. coli ispALaFS-NA在含有3.0%（v/v）甘油和0.1 mM IPTG的2YT培养基中培养48 h，α-法尼烯产量达380.0 mg/L，较初始菌株E. coli wFS的1.2 mg/L提高约317倍。密码子优化使产量提高1.3倍
- 过表达dxs和idi分别使产量提高1.6倍和5.2倍
- 引入MVA途径（pSSN12Didi）后产量达17.8 mg/L（提高14.8倍）
- 共表达ispA后产量达57.6 mg/L（提高48.0倍）
- 融合蛋白（IspALaFS）在添加5 mM甲羟戊酸时产量为86.8 mg/L，在15 mM甲羟戊酸时达到153.6 mg/L
- 使用完整MVA途径（pSNA）并以甘油为碳源时产量最高达380.0 mg/L。此外，融合蛋白菌株未检测到FOH副产物，而ispAaFS-SN菌株FOH产量最高为17.8 mg/L。在4.0%（v/v）甘油条件下，甲羟戊酸积累达23.8 mM，α-法尼烯得率为18.4 mg/g甘油（为理论得率的7.5%）。
研究结论
通过密码子优化、MVA途径引入和蛋白融合等策略，成功在大肠杆菌中实现了α-法尼烯的高水平生产（380.0 mg/L），证实了该策略的有效性。但甲羟戊酸积累表明MVA途径下游存在瓶颈，需进一步优化下游酶活或改造代谢网络以提高产量和得率。