A Role of the Amino Acid Residue Located on the Fifth Position before the First Aspartate-rich Motif of Farnesyl Diphosphate Synthase on Determination of the Final Product
- 作者
- Shin-ichi Ohnuma, Keishi Narita, Takeshi Nakazawa, Chika Ishida, Yoshie Takeuchi, Chikara Ohto, Tokuzo Nishino
- 单位
- Department of Biochemistry and Engineering, Tohoku University; Bio Research Laboratory, Toyota Motor Corporation
- 杂志
- Journal of Biological Chemistry（1996）
- DOI
- 10.1074/jbc.271.48.30748
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
阐明法尼基二磷酸(FPP)合酶中位于第一个天冬氨酸富集基序前第五位氨基酸残基(第81位)如何决定最终产物链长
研究策略
通过定点突变将Bacillus stearothermophilus FPP合酶第81位酪氨酸分别替换为其他19种氨基酸，分析各突变体的产物分布、动力学常数及与氨基酸溶剂可及表面积的关系
核心内容
该研究通过定点突变系统解析了嗜热脂肪芽孢杆菌法尼基二磷酸（FPP）合酶第81位氨基酸残基对产物链长的决定机制。研究者将该位点的酪氨酸分别替换为其余19种氨基酸，并在大肠杆菌中表达各突变体，分析其产物分布与动力学参数。结果显示，第81位残基的侧链大小直接决定了最终产物长度：替换为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸时可产生六异戊二烯二磷酸（C30），替换为半胱氨酸、组氨酸等七种氨基酸时产物为C25，而替换为天冬氨酸、谷氨酸等七种氨基酸则仅限于C20，脯氨酸突变导致完全失活，色氨酸替换不改变产物特异性。进一步分析发现，以DMAPP为底物时产物平均链长与取代氨基酸的溶剂可及表面积呈反比，相关系数为0.818，以GPP和FPP为底物时相关系数分别为0.887和相近值。动力学测定显示Y81A对GGPP的Km为2.07 μM，Y81G为0.217 μM，但两者Vmax分别为42.5和31.7 nmol/min/mg。这些结果揭示第81位氨基酸通过侧链与延伸中烯丙基产物ω末端发生疏水接触，以空间位阻终止链延长，其侧链可及表面积越小则产物链越长，为异戊二烯转移酶链长决定机制提供了结构模型。
创新点
系统性地替换单个氨基酸残基并揭示产物平均链长与取代氨基酸溶剂可及表面积呈反比关系，提出第81位氨基酸直接接触延伸中的烯丙基产物ω末端从而终止链延长的模型
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | 类异戊二烯生物合成途径 | farnesyl diphosphate synthase gene from Bacillus stearothermophilus | 法尼基二磷酸合酶(FPP合酶)及其第81位突变体(Y81A, Y81G, Y81S, Y81C, Y81H, Y81I, Y81L, Y81N, Y81T, Y81V, Y81D, Y81E, Y81F, Y81K, Y81M, Y81Q, Y81R, Y81W, Y81P) | 催化 | 第81位酪氨酸位于第一个天冬氨酸富集基序前第五位；突变后产物链长改变 |
关键发现
- 野生型FPP合酶以FPP(C15)为最终产物
- Y81A、Y81G、Y81S可产生六异戊二烯二磷酸(C30)
- Y81C、Y81H、Y81I、Y81L、Y81N、Y81T、Y81V的最终产物为香叶基法尼基二磷酸(C25)
- Y81D、Y81E、Y81F、Y81K、Y81M、Y81Q、Y81R不能产生超过香叶基香叶基二磷酸(C20)的多聚异戊二烯二磷酸
- Y81P完全失活
- Y81W不影响产物特异性。以DMAPP为底物时平均链长与取代氨基酸的溶剂可及表面积呈反比，相关系数0.818
- 以GPP和FPP为底物时相关系数分别为0.887和类似。Y81A对GGPP的Km为2.07 μM，Y81G对GGPP的Km为0.217 μM，但两者对GGPP的Vmax分别为42.5和31.7 nmol/min/mg。
研究结论
第81位氨基酸残基通过其侧链大小直接接触延伸中烯丙基产物的ω末端，以疏水相互作用阻止IPP的进一步缩合，从而决定FPP合酶的最终产物链长；该位置氨基酸的可及表面积越小，产物链越长。