Engineered heterologous FPP synthases-mediated \(Z,E\) -FPP synthesis in E. coli
- 作者
- Chonglong Wang, Jia Zhou, Hui-Jeong Jang, Sang-Hwal Yoon, Jae-Yean Kim, Seung-Goo Lee, Eui-Sung Choi, Seon-Won Kim
- 单位
- Division of Applied Life Science (BK21 Program), PMBBRC, Gyeongsang National University, Jinju 660-701, Republic of Korea; Industrial Biotechnology Research Center, KRIBB, Daejeon 305-806, Republic of Korea
- 杂志
- Metabolic Engineering（2013）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2013.04.002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌中尚未实现Z型法尼基焦磷酸（Z-type FPP）的合成，需要构建能产生Z,E-FPP的工程菌株，以用于合成特定倍半萜。
研究策略
将大肠杆菌E,E-FPP合酶IspA与结核分枝杆菌Z,E-FPP合酶Rv1086通过甘氨酸-丝氨酸连接肽融合成嵌合酶ILRv，并引入外源甲羟戊酸（MVA）途径底部模块供应IPP和DMAPP，通过竞争性利用IspA释放的GPP实现Z,E-FPP的定向合成。
核心内容
该研究首次在大肠杆菌中实现了Z,E-法尼基焦磷酸（Z,E-FPP）的生物合成。作者将大肠杆菌自身的E,E-FPP合酶IspA与结核分枝杆菌的Z,E-FPP合酶Rv1086通过甘氨酸-丝氨酸连接肽融合为嵌合酶ILRv，并引入外源甲羟戊酸途径的底部模块以供应IPP和DMAPP前体，使IspA释放的GPP被Rv1086竞争性利用，从而将碳流导向Z,E-FPP的合成。在含1%甘油和5 mM甲羟戊酸的2YT培养基中，携带融合酶和MVA底部模块的菌株实现了Z,E-法尼醇（Z,E-FOH）115.6 mg/L的产量，占总法尼醇的80.7%，且总FOH达143.3 mg/L。相比分开共表达IspA和Rv1086时仅7.7 mg/L的产量（占比6.5%），融合策略将Z,E-FOH产量提高了15倍。单独表达Rv1086时Z,E-FOH仅占39.5%，而过表达IspA则只产生E,E-FOH。进一步研究发现，Z,E-FPP不被大肠杆菌内源代谢途径消耗，且不能替代E,E-FPP支持ΔispA菌株生长，说明该前体可专供目标倍半萜合成而不与必需类异戊二烯代谢竞争。该融合酶策略为在大肠杆菌中利用Z,E-FPP合成特定倍半萜提供了无前体损失的宿主平台。
创新点
['首次在大肠杆菌中实现Z,E-FPP的生物合成，并使其成为主要产物', '利用IspA-Rv1086融合蛋白将GPP底物流定向导向Z,E-FPP合成', '证明Z,E-FPP不被大肠杆菌内源代谢途径消耗，可成为倍半萜合成的专用前体']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸（MVA）途径（底部模块，pSSN12Didi编码） | ispA | IspA (E,E-FPP合酶) | 催化 | 天然合成E,E-FPP，在融合蛋白中提供GPP释放功能 |
| Escherichia coli DH5α | 类异戊二烯生物合成途径 | Rv1086 | Rv1086 (Z,E-FPP合酶) | 催化 | 来自结核分枝杆菌，催化GPP与IPP缩合生成Z,E-FPP |
| Escherichia coli DH5α | 类异戊二烯生物合成途径 | ispA-Rv1086 (融合基因) | ILRv融合蛋白 (IspA-Rv1086) | 催化 | 通过(GGGGS)连接肽融合，主要产生Z,E-FPP，占80.7% |
| Escherichia coli DH5α | 类异戊二烯生物合成途径 | ispA(S80F)-Rv1086 (突变融合基因) | IspA S80F-Rv1086 (IS80F LRv) | 催化 | S80F突变使IspA仅合成GPP，Z,E-FOH比例较SN-Rv提高1.7倍，但不能恢复ΔispA生长 |
| Escherichia coli DH5α | 内源磷酸酶水解途径 | 内源磷酸酶基因 | 内源磷酸酶 | 催化 | 将FPP（包括Z,E-FPP）水解为对应的法尼醇（FOH），用于产物检测 |
| Escherichia coli DH5α ΔispA | 甲羟戊酸（MVA）途径 | ispA-Rv1086 | ILRv融合蛋白 | 催化 | 在ispA缺失菌株中恢复生长，证明IspA结构域有活性 |
关键发现
- 含MVA途径底部模块和融合FPP合酶（ILRv）的大肠杆菌在含1%（v/v）甘油和5mM甲羟戊酸的2YT培养基中，Z,E-法尼醇（Z,E-FOH）产量达115.6 mg/L，占总FOH产量的80.7%（总FOH 143.3 mg/L）
- 与分开共表达IspA和Rv1086相比（7.7 mg/L，仅占6.5%），Z,E-FOH产量提高15倍。单独表达Rv1086（SN-Rv）时总FOH为75.3 mg/L，其中Z,E-FOH占39.5%
- 过表达IspA（SN-I）时总FOH为128.0 mg/L且仅产E,E-FOH。融合蛋白ILRv在native-PAGE中呈现约130 kDa（二聚体）和260 kDa（四聚体）条带。突变体IspA S80F-Rv1086（IS80F LRv）的Z,E-FOH比例较SN-Rv提高1.7倍，但不能恢复ΔispA菌株的生长，表明Z,E-FPP不能用于大肠杆菌必需类异戊二烯的合成。
研究结论
通过将M. tuberculosis的Z,E-FPP合酶Rv1086与E. coli的E,E-FPP合酶IspA融合，可在大肠杆菌中高效生产Z,E-FPP，且该底物不被内源代谢消耗，为利用Z,E-FPP合成目标倍半萜提供了一种无前体损失的平台。