核心问题：在毕赤酵母中表达并纯化具有抗肿瘤和抗血管生成活性的人RNASET2糖蛋白，并验证其功能及与紫杉醇的协同作用
关键发现：纯化的重组RNASET2为27 kDa糖蛋白，具有RNase活性和耐热性（煮沸仍保持活性） 等 5 条
核心问题：倍半萜烯合酶催化反应中，产物疏水性强导致在水相中溶解度低，反应易受产物抑制；传统两相批量反应传质受限，难以放大且需较长反应时间。
关键发现：以aristolochone synthase（AS）为模型酶，在0.5 mm内径管路、水相/有机相=1:1、反应时间90 min条件下，AS催化FDP产率达96%（表2 Entry 9） 等 4 条
核心问题：三萜环化酶中SHC和OSC序列相似性低，但结构相似，缺乏统一的家族分类和功能注释，难以系统地进行蛋白质工程改造
关键发现：TTCED数据库包含639个非冗余三萜环化酶序列，分为SHC超家族（325个）和OSC超家族（314个），共20个同源家族 等 10 条
核心问题：开发一种快速、简单、高效的冷冻保存粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的醋酸锂（LiAc）转化方法，以解决传统LiAc方法步骤繁琐、耗时长的缺陷。
关键发现：未冷冻时转化效率为3.5±2.1×10^4转化子/μg DNA 等 7 条
核心问题：开发一种简便的克隆载体筛选系统，利用类胡萝卜素生物合成基因产生颜色差异来区分重组子与非重组子，避免使用X-Gal和IPTG等特殊指示剂。
关键发现：构建了7.0 kb的克隆载体pSL775，含ColE1复制起点和氨苄青霉素抗性基因，具有11个单一克隆位点（Asp718, Aval, BamHI, BanII, EcoRV, HindIII, KpnI, MluI, NcoI, NotI, SmaI） 等 5 条
核心问题：开发一种利用纯化的酪氨酸位点特异性重组酶在体外快速构建和多样化代谢通路的方法
关键发现：Cre/loxP和VCre/Vlox系统在2小时孵育后重组率约30%，Dre/Rox约15% 等 2 条
核心问题：如何通过定向进化改造类胡萝卜素合成酶，使其能够合成自然界不存在的非天然类胡萝卜素骨架。
关键发现：通过易错PCR成功获得CrtM突变体，关键氨基酸F26和W38控制链长特异性 等 4 条
核心问题：传统多基因生化通路构建涉及多步克隆（引物设计、PCR、酶切、体外连接、转化等），耗时低效且依赖稀有酶切位点；需要一种一步式、不依赖限制性酶切位点的快速组装方法。
关键发现：以玉米黄素（zeaxanthin）合成通路为例，DNA assembler可成功组装由crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ五个基因组成的通路 等 5 条
核心问题：在水稻原生质体直接基因转移体系中，评估潮霉素抗性（HPT）和氨甲蝶呤抗性（DHFR）作为选择标记的有效性，以及GUS和NOS作为报告基因的表达可靠性。
关键发现：PEG介导转化效率为每10^6原生质体获得20-25个转化体，电穿孔仅0-3个 等 4 条
核心问题：探索天蓝色链霉菌原生质体融合后基因重组的基本特征，包括亲本基因组是否完整参与交换、能否发生多轮重组以及能否发生多亲本融合。
关键发现：六因子杂交中重组频率高达17%（平均14.4%） 等 5 条
核心问题：能否在酿酒酵母中异源表达古菌膜蛋白细菌视蛋白（bacterio-opsin），并研究其膜定位、N端加工及功能性色素形成能力。
关键发现：['bop基因（前体形式和成熟形式）均能在酿酒酵母中转录和翻译，转录本约1100 nt。', 'BO蛋白在膜部分富集，定位于蔗糖梯度39-41%处，与质膜标记H+-ATPase共分离，细胞质中无BO。', '前体形式BO在AH22菌株中被加工为与天然成熟BO大小相同的蛋白，加工效率在最小培养基... 等 2 条
核心问题：类胡萝卜素生物合成基因的序列未知，相关酶的性质和基因调控机制不明确，缺乏基因特异性探针。
关键发现：测定了荚膜红细菌类胡萝卜素基因簇的完整11039 bp核苷酸序列，该簇包含七个已知基因（crtA, crtB, crtC, crtD, crtE, crtF, crtI）和一个新基因crtK 等 6 条
核心问题：解决大肠杆菌克隆载体无法直接应用于Pseudomonas stutzeri的问题，实现高频电转化。
关键发现：pHSG298电穿孔最大转化频率达2×10^7 transformants/μg DNA 等 5 条
核心问题：探索利用嗜盐古菌（Halobacterium salinarum）中细菌视紫红质的高效表达机制，实现人β2-肾上腺素能受体的异源表达，以评估古菌作为真核膜蛋白表达宿主的可行性。
关键发现：在H. salinarum中，β2-AR mRNA约为BO mRNA的1/8（8±2倍差异） 等 3 条
核心问题：研究2-甲基异冰片（2-MIB）生物合成相关Cnb蛋白的功能，尤其是它们在细胞内2-MIB保留中的作用。
关键发现：含cnbA-mtf-mtc-cnbB的大肠杆菌菌株细胞内2-MIB浓度为0.004 μg/ml/OD600，细胞外为0.0018 μg/ml/OD600 等 2 条
核心问题：开发一种利用光合细菌Rhodovulum sulfidophilum的全细胞砷生物传感器，通过肉眼可见的颜色变化检测亚砷酸盐，无需添加特殊试剂或设备，适用于缺乏电力的现场检测。
关键发现：构建的传感器菌株CDM2(pSENSE-As)在亚砷酸盐浓度为5 μg/L时发生从黄色到红色的清晰颜色变化，3 μg/L时出现轻微变化 等 6 条
核心问题：阐明迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）双精氨酸转运（Tat）系统的生物学功能，并探索将其作为海洋鱼类减毒活疫苗（LAV）生物遏制系统的可行性。
关键发现：E. tarda Tat系统功能正常，ssTorA::GFP在野生株中成熟转运至周质，在ΔtatABCD中滞留于胞质。 等 7 条
核心问题：评估S. albus J1074染色体亚端粒区域的可删除性，构建基因组缩减菌株以优化异源宿主，并解析自发突变中类胡萝卜素基因簇激活的机制。
关键发现：S. albus J1074染色体为6.841 Mb，左右端粒臂分别为0.3和0.4 Mb。通过loxP/Cre系统删除204 kb片段（Del1），随后实现染色体环化（Del2），相对野生型共减少307 kb。自发突变体Pink和Orange分别缺失422,388 bp和420,240 bp... 等 2 条
核心问题：探索酪氨酸O-异戊烯基转移酶TyrPT和SirD能否接受非天然的烷基/苄基焦磷酸供体（MAPP、2-戊烯基焦磷酸、苄基焦磷酸）进行烷基化/苄基化反应，并确定其区域选择性和催化效率。
关键发现：以DMAPP为供体时，TyrPT对L-酪氨酸(1a)转化率为89.1%，SirD为99.3% 等 9 条
核心问题：首次鉴定并表征 Penicillium roqueforti 中参与 PR 毒素生物合成的基因簇，并通过基因沉默验证三个新基因（ORF5、ORF6、ORF8）在 PR 毒素合成中的作用。
关键发现：在 P. roqueforti FM164 基因组中鉴定出约 等 4 条