Using Purified Tyrosine Site-Specific Recombines In Vitro to Rapidly Construct and Diversify Metabolic Pathways
- 作者
- Wei Liu, Laura R. Tuck, Jon Marles Wright, Yizhi Cai
- 杂志
- Methods in Molecular Biology
- DOI
- 10.1007/978-1-4939-7169-5_18
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
开发一种利用纯化的酪氨酸位点特异性重组酶在体外快速构建和多样化代谢通路的方法
研究策略
通过镍亲和层析纯化Cre、VCre和Dre重组酶，验证其体外功能；利用VCre将酵母启动子文库组合整合到β-胡萝卜素生物合成通路中，实现通路优化
核心内容
本研究开发了一种利用纯化的酪氨酸位点特异性重组酶在体外快速构建和多样化代谢通路的方法。研究者通过镍亲和层析纯化了Cre、VCre和Dre三种重组酶，并首次验证了VCre和Dre的体外重组活性。实验显示，Cre/loxP和VCre/Vlox系统在2小时孵育后重组率约为30%，而Dre/Rox系统约为15%；三种酶的整合率分别为Cre约4%、VCre约3%和Dre约1.5%。在此基础上，研究者利用正交重组酶VCre将酵母启动子文库组合整合到β-胡萝卜素生物合成通路中，成功实现了通路的一步构建与优化。该方法避免了体内重组受限于细胞环境的问题，提供了一种快速、可组合的体外DNA组装策略，为代谢途径的工程化改造和多样化提供了新工具，尤其适用于需要高通量筛选启动子组合以优化目标产物合成的场景。
创新点
首次验证了VCre和Dre在体外重组活性；建立了基于体外重组酶的代谢通路一步构建和优化方法；利用正交重组酶实现组合启动子整合
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | — | cre | Cre recombinase | 催化 | 重组酶表达与纯化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | — | vcre | VCre recombinase | 催化 | 重组酶表达与纯化 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | — | dre | Dre recombinase | 催化 | 重组酶表达与纯化 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | β-胡萝卜素生物合成 | CrtI | CrtI | 催化 | β-胡萝卜素合成相关酶 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | β-胡萝卜素生物合成 | CrtE | CrtE | 催化 | β-胡萝卜素合成相关酶 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | β-胡萝卜素生物合成 | CrtYB | CrtYB | 催化 | β-胡萝卜素合成相关酶 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | — | — | — | 调控 | YeastFab启动子文库用于通路优化 |
关键发现
- Cre/loxP和VCre/Vlox系统在2小时孵育后重组率约30%，Dre/Rox约15%
- 整合率分别为Cre约4%、VCre约3%、Dre约1.5%。Cre、Dre、VCre蛋白大小分别为39.9 kDa、39.6 kDa和43.8 kDa。通过VCre介导的启动子整合成功实现了酵母β-胡萝卜素通路的多样化。
研究结论
本研究证明VCre和Dre在体外具有功能，并开发了一种利用纯化重组酶进行体外DNA重组的代谢途径工程方法，可快速构建和优化生物合成途径。