A rapid and simple procedure for high-efficiency lithium acetate transformation of cryopreserved Schizosaccharomyces pombe cells
- 作者
- Minoru Suga, Toyomasa Hatakeyama
- 单位
- Department of Materials and Biosystem Engineering, Toyama University
- 杂志
- Yeast（2005）
- DOI
- 10.1002/yea.1247
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
开发一种快速、简单、高效的冷冻保存粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的醋酸锂（LiAc）转化方法，以解决传统LiAc方法步骤繁琐、耗时长的缺陷。
研究策略
将冷冻保护剂甘油与醋酸锂（LiAc）结合，优化甘油浓度（30%），并简化转化流程（省略离心洗涤和预孵育步骤），实现冷冻保存的感受态细胞直接用于转化。
核心内容
该研究开发了一种快速、简单且高效的粟酒裂殖酵母冷冻感受态细胞醋酸锂转化方法。传统LiAc转化法步骤繁琐、耗时长，本研究将30%甘油与醋酸锂共同冷冻保存感受态细胞，省去了离心洗涤和预孵育步骤，使冷冻细胞无需去除甘油即可直接用于转化。结果显示，未冷冻时转化效率为3.5±2.1×10⁴转化子/μg DNA，而采用30%甘油冷冻后效率提高14倍以上，在ura4-菌株中最高达2.6±1.3×10⁶转化子/μg DNA，约提高220倍；优化后的快速方案最大转化效率为2.1±0.7×10⁶转化子/μg DNA，总用时仅20分钟。研究还发现冷冻时LiAc的存在至关重要，缺少时效率降至约20%，冷冻细胞在-80℃可保存至少3个月而无显著效率损失。该方法大幅简化了操作流程并显著提升转化效率，为粟酒裂殖酵母的常规基因表达和功能分析提供了实用工具。
创新点
发现高浓度甘油（30%）与LiAc共同冷冻能显著提高转化效率，比传统10-15%甘油浓度更优；冷冻后的感受态细胞可直接用于转化，无需去除甘油；整个流程仅需20分钟，且转化效率超过10^6转化子/μg DNA。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Schizosaccharomyces pombe ATCC38399 (h- leu1-32) | 亮氨酸合成 | leu1 | 异丙基苹果酸异构酶 | 催化 | 营养筛选标记，用于质粒pAL7转化子的选择 |
| Schizosaccharomyces pombe ATCC38436 (h- ura4-294) | 嘧啶合成 | ura4 | 乳清苷-5'-磷酸脱羧酶 | 催化 | 营养筛选标记，用于质粒pAU5转化子的选择 |
| Schizosaccharomyces pombe TK107 (h- phh1::ura4+ ura4-D18 leu1-32) | 渗透胁迫信号 | phh1 | Phh1 MAP激酶 | 调控 | 渗透敏感突变株，高浓度甘油（>20%）降低转化效率 |
关键发现
- 未冷冻时转化效率为3.5±2.1×10^4转化子/μg DNA
- 用30%甘油冷冻后效率提高14倍以上
- ura4-菌株冷冻后效率提高约220倍，最高达2.6±1.3×10^6转化子/μg DNA
- 无冷冻时30%甘油处理效率提高约10倍，25% DMSO提高约4倍
- 冷冻时LiAc的存在至关重要，无LiAc时效率降至约20%
- 冷冻细胞在-80℃可保存至少3个月无显著效率损失
- 优化后的快速简化方案最大转化效率为2.1±0.7×10^6转化子/μg DNA，总用时仅20分钟。
研究结论
本研究建立了一种快速、简单、高效的粟酒裂殖酵母冷冻感受态细胞LiAc转化法，通过使用30%甘油和LiAc共同冷冻，大幅提高转化效率并简化操作，适用于常规基因表达和功能分析。