Tyrosine O-prenyltransferases TyrPT and SirD displaying similar behavior toward unnatural alkyl or benzyl diphosphate as their natural prenyl donor dimethylallyl diphosphate
- 作者
- Huili Yu, Mike Liebhold, Xiulan Xie, Shu-Ming Li
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2015）
- DOI
- 10.1007/s00253-015-6452-1
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
探索酪氨酸O-异戊烯基转移酶TyrPT和SirD能否接受非天然的烷基/苄基焦磷酸供体（MAPP、2-戊烯基焦磷酸、苄基焦磷酸）进行烷基化/苄基化反应，并确定其区域选择性和催化效率。
研究策略
异源表达并纯化TyrPT和SirD，以DMAPP类似物（MAPP、2-pen-PP、benzyl-PP）为供体、酪氨酸及其衍生物为受体进行体外酶促反应，通过HPLC测定转化率，制备产物并经NMR和HR-EI-MS鉴定结构，测定动力学参数。
核心内容
本研究以酪氨酸O-异戊烯基转移酶TyrPT和SirD为对象，在大肠杆菌SoluBL21中异源表达并纯化后，以三种非天然的烷基/苄基焦磷酸供体——MAPP、2-戊烯基焦磷酸和苄基焦磷酸——替代天然供体DMAPP，对L-酪氨酸及其衍生物进行体外酶促反应。通过HPLC测定转化率，并经NMR和HR-EI-MS鉴定产物结构，同时测定动力学参数。结果显示，两种酶均能接受非天然供体完成烷基化或苄基化反应，且产物均为单一区域选择性的4-O或4-N取代衍生物，与天然DMAPP供体时一致。以DMAPP为供体时，TyrPT和SirD对L-酪氨酸的转化率分别达89.1%和99.3%；而以MAPP、2-pen-PP和benzyl-PP为供体时转化率有所下降，例如SirD以benzyl-PP对4-氨基-L-苯丙氨酸的转化率为54.6%，但对L-酪氨酸仅1.3%。动力学分析表明，各非天然供体的kcat均低于2 min⁻¹，催化效率较天然供体低。本研究首次证明这两种酶可拓展底物谱用于化学酶法合成结构多样的烷基化酪氨酸衍生物，但活性偏低，未来可通过定点突变加以改进。
创新点
首次证明酪氨酸O-异戊烯基转移酶TyrPT和SirD能够接受非天然烷基/苄基供体，且其O-/N-烷基化/苄基化位点与天然供体DMAPP一致（4-O或4-N），不同于此前报道的吲哚异戊烯基转移酶在类似物存在下发生区域选择性偏移。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli SoluBL21 | DMATS超家族异戊烯基转移反应 | sirD | SirD | 催化 | 来自Leptosphaeria maculans，催化酪氨酸O-异戊烯基化，天然供体为DMAPP，可接受非天然烷基/苄基供体 |
| Escherichia coli SoluBL21 | DMATS超家族异戊烯基转移反应 | tyrPT | TyrPT | 催化 | 来自Aspergillus niger，催化酪氨酸O-异戊烯基化，天然供体为DMAPP，可接受非天然烷基/苄基供体 |
关键发现
- 以DMAPP为供体时，TyrPT对L-酪氨酸(1a)转化率为89.1%，SirD为99.3%
- 以MAPP为供体时，TyrPT对1a转化率21.2%，SirD
- 0%，对4-氨基-L-苯丙氨酸(2a)分别为57.7%和34.8%
- 以2-pen-PP为供体时，TyrPT对1a转化率56.6%，SirD
- 3%，对2a分别为46.4%和42.6%
- 以benzyl-PP为供体时，TyrPT对2a转化率67.2%，SirD
- 6%，但对1a仅2.2%和1.3%
- 分离并鉴定了9个产物，均为单一区域选择性产物，即4-O-或4-N-烷基化/苄基化衍生物
- 动力学参数：TyrPT对MAPP的KM=0.029 mM，kcat=0.12 min⁻¹，kcat/KM=4.14 min⁻¹mM⁻¹；SirD对MAPP的KM=0.13 mM，kcat=0.16 min⁻¹，kcat/KM=1.23；TyrPT对2-pen-PP的KM=0.23 mM，kcat=0.20 min⁻¹，kcat/KM=0.87；SirD对2-pen-PP的KM=0.22 mM，kcat=0.13 min⁻¹，kcat/KM=0.59；TyrPT对benzyl-PP（以2a为底物）的KM=0.52 mM，kcat=0.96 min⁻¹，kcat/KM=1.85；SirD对benzyl-PP的KM=0.75 mM，kcat=1.68 min⁻¹，kcat/KM=2.24。
研究结论
TyrPT和SirD能够接受非天然的MAPP、2-pen-PP和benzyl-PP作为烷基/苄基供体，催化酪氨酸及其衍生物的O-/N-烷基化/苄基化，且区域选择性与天然供体DMAPP相同（4-O或4-N位）。这扩展了这两种酶在化学酶法合成结构多样化烷基化化合物中的应用潜力，但其催化效率较低（kcat均低于2 min⁻¹），未来可通过定点突变提高活性。