Optimising Terpene Synthesis with Flow Biocatalysis
- 作者
- Xiaoping Tang, Rudolf K. Allemann, Thomas Wirth
- 单位
- Cardiff School of Chemistry, Cardiff University
- 杂志
- Eur. J. Org. Chem.（2017）
- DOI
- 10.1002/ejoc.201601388
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
倍半萜烯合酶催化反应中，产物疏水性强导致在水相中溶解度低，反应易受产物抑制；传统两相批量反应传质受限，难以放大且需较长反应时间。
研究策略
采用分段流（segmented flow）系统，通过T型混合器形成交替的水相/有机相段，增大传质面积；使用实验设计（DoE）方法系统优化管径、两相比例和反应时间等关键参数。
核心内容
本研究针对倍半萜烯合酶催化中产物疏水性强、水相溶解度低及产物抑制导致的传质受限和产率低下问题，构建了分段流生物催化反应系统。通过T型混合器形成交替的水相/有机相段以增大传质面积，并借助实验设计（DoE）系统优化管径、两相比例及反应时间等关键参数。以aristolochone synthase（AS）为模型酶，在0.5 mm内径管路、水相/有机相=1:1、反应时间90 min条件下，催化FDP产率达96%；而管径增大至1.0 mm时产率显著下降至最高13%。使用amorphadiene synthase（ADS）时，在2 μM酶浓度下获得近70%的amorpha-4,11-diene产率。戊烷被确定为最佳有机溶剂，可干净萃取产物且不引起酶失活。结果表明，分段流系统结合DoE优化能显著提升萜烯合酶合成效率，通过精确控制液段尺寸和流动条件实现高传质速率而不损害酶活性，为高价值倍半萜的连续流生产提供了高效、可放大的方案。
创新点
开发了适用于倍半萜合成酶的高效分段流动反应器，通过DoE在少量实验中确定最优条件，实现了近定量产率，并避免了酶失活。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21 | 倍半萜生物合成 | AS（aristolochone synthase）cDNA | aristolochone synthase (AS) | 催化 | 模型酶，催化FDP环化生成倍半萜，在E. coli中表达并纯化。 |
| Escherichia coli BL21 | 倍半萜生物合成（青蒿素前体） | ADS（amorphadiene synthase）基因 | amorphadiene synthase (ADS) | 催化 | 来自黄花蒿，催化FDP转化为amorpha-4,11-diene，是青蒿素合成关键中间体；在2 μM浓度下使用时产率约70%。 |
| Escherichia coli BL21 | 底物合成 | — | — | 催化 | FDP（法尼基二磷酸）为底物，在实验中通过化学合成制备，浓度为0.35 mM。 |
关键发现
- 以aristolochone synthase（AS）为模型酶，在0.5 mm内径管路、水相/有机相=1:1、反应时间90 min条件下，AS催化FDP产率达96%（表2 Entry 9）
- 在1.0 mm内径管路中产率显著下降（最高13%）
- 使用amorphadiene synthase（ADS）时，在2 μM酶浓度下获得近70%的amorpha-4,11-diene产率
- 戊烷为最佳有机溶剂，可干净萃取产物且不引起酶失活。
研究结论
分段流系统结合DoE优化能显著提升萜烯合酶的合成效率，通过精确控制液段尺寸和流动条件，可实现高传质速率而不损害酶活性，为高价值倍半萜的生产提供了高效、可放大的连续流方案。