Transgenic rice cell lines and plants: expression of transferred chimeric genes
- 作者
- E.G.M. Meijer, R.A. Schilperoort, S. Rueb, P.E. van Os-Ruygrok, L.A.M. Hensgens
- 单位
- Dept. of Plant Molecular Biology, Clusius Laboratory, Leiden University, Wassenaarseweg 64, 2333 AL Leiden, Netherlands
- DOI
- 10.1007/BF00015073
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
在水稻原生质体直接基因转移体系中，评估潮霉素抗性（HPT）和氨甲蝶呤抗性（DHFR）作为选择标记的有效性，以及GUS和NOS作为报告基因的表达可靠性。
研究策略
通过PEG介导的原生质体转化将含有HPT-GUS嵌合基因的质粒pHH271和含有DHFR-NOS嵌合基因的质粒pMON806导入水稻（Oryza sativa cv. Taipei 309）悬浮细胞系来源的原生质体，经药物筛选得到转基因细胞系和再生植株，并利用Southern/Northern blot、组织化学染色和酶活性测定分析外源基因的整合与表达。
核心内容
该研究以水稻（Oryza sativa cv. Taipei 309）悬浮细胞原生质体为受体，通过PEG介导的直接基因转移，评估了潮霉素抗性（HPT）和氨甲蝶呤抗性（DHFR）选择标记及GUS、NOS报告基因的表达可靠性。PEG转化获得每10^6原生质体20–25个转化体，优于电穿孔的0–3个。转基因细胞系可耐受1000 μg/ml潮霉素或20 μg/ml氨甲蝶呤，首次证实小鼠DHFR基因能在水稻中赋予氨甲蝶呤抗性，且根癌农杆菌mas双启动子在单子叶细胞中具有功能。GUS组织化学染色阳性比例在培养期内先升后降，5-氮杂胞苷处理可使部分细胞系第9天阳性率从5%升至90%，如5H2B在第6天达到100%阳性；酶活性测定显示5H2B处理第6天为245 pmol/min/mg蛋白。再生植株叶片和根中检测到GUS活性，主要定位于维管束。Northern分析检测到HPT和DHFR转录本，但未检测到GUS和NOS转录本，提示DNA甲基化可能影响报告基因表达，基于组织化学染色的转化体筛选需结合酶活性测定才可靠。
创新点
首次证实在水稻中可利用小鼠DHFR基因赋予氨甲蝶呤抗性作为选择标记；证明根癌农杆菌甘露碱合酶（mas）的1',2'双启动子在禾本科单子叶植物细胞中具有功能；发现5-氮杂胞苷可提高GUS组织化学染色阳性细胞比例，提示DNA甲基化可能影响报告基因表达。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Oryza sativa L. cv. Taipei 309 (japonica) 悬浮细胞来源的原生质体 | 外源基因表达 | HPT | 潮霉素磷酸转移酶 | 催化 | 赋予潮霉素抗性，由CaMV 35S启动子驱动，含NOS终止序列 |
| Oryza sativa L. cv. Taipei 309 (japonica) 悬浮细胞来源的原生质体 | 外源基因表达 | GUS (uidA) | β-葡萄糖醛酸酶 | 催化 | 报告基因，由农杆菌mas 1',2'双启动子驱动，含基因0'终止序列 |
| Oryza sativa L. cv. Taipei 309 (japonica) 悬浮细胞来源的原生质体 | 外源基因表达 | DHFR (小鼠突变型) | 二氢叶酸还原酶 | 催化 | 赋予氨甲蝶呤抗性，由CaMV 35S启动子驱动，含NOS终止序列 |
| Oryza sativa L. cv. Taipei 309 (japonica) 悬浮细胞来源的原生质体 | 外源基因表达 | NOS | 胭脂碱合酶 | 催化 | 报告基因，含NOS自身启动子和终止序列，但未检测到表达 |
| Oryza sativa L. cv. Taipei 309 (japonica) 悬浮细胞来源的原生质体 | 外源基因表达调控 | mas 1',2'双启动子 | — | 调控 | 来自根癌农杆菌Ti质粒TR-DNA的甘露碱合酶基因启动子，驱动GUS基因 |
关键发现
- PEG介导转化效率为每10^6原生质体获得20-25个转化体，电穿孔仅0-3个
- 转基因细胞系中HPT基因拷贝数为1-5/二倍体，GUS基因为2-4拷贝，DHFR基因为1-3拷贝
- 细胞系可耐受1000 μg/ml潮霉素或20 μg/ml氨甲蝶呤。GUS组织化学染色阳性细胞比例在12天培养期内先升后降，例如4H1在第3天阳性率30%（对照）vs 35%（5-AZA），第9天为5%（对照）vs 90%（5-AZA）
- 5H2B在5-AZA处理下第6天达100%阳性。GUS酶活性测定显示4H1无5-AZA时第3天为95 pmol/min/mg蛋白，5H2B在5-AZA处理第6天为245 pmol/min/mg蛋白。再生植株叶片和根中检测到GUS活性，主要定位于维管束。Northern分析检测到HPT转录本（约1235 nt）和DHFR转录本，但未检测到GUS和NOS的转录本。
研究结论
潮霉素和氨甲蝶呤抗性嵌合基因在水稻转基因细胞中均可表达并赋予相应抗性；mas双启动子在转基因水稻细胞系和再生植株的多种细胞类型中有功能；GUS可用作水稻报告基因，但基于组织化学染色的转化体筛选可能不可靠，需结合酶活性测定。