Penicillium roqueforti PR toxin gene cluster characterization
- 作者
- Pedro I. Hidalgo, Elisabeth Poirier, Ricardo V. Ullán, Justine Piqueras, Laurence Meslet- Cladière, Emmanuel Coton, Monika Coton
- 单位
- Université de Brest, EA 3882 Laboratoire Universitaire de Biodiversité et d'Ecologie Microbienne, IBSAM, ESIAB, Technopole Brest- Iroise, Plouzané, 29280 Brest, France; mAbxience, Upstream Production, Parque Tecnológico de León, Julia Morros s/n, Armunia, 24009 León, Spain
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s00253-016-7995-5
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
首次鉴定并表征 Penicillium roqueforti 中参与 PR 毒素生物合成的基因簇，并通过基因沉默验证三个新基因（ORF5、ORF6、ORF8）在 PR 毒素合成中的作用。
研究策略
利用已注释的 P. roqueforti FM164 基因组进行 in silico 分析，鉴定 PR 毒素生物合成基因簇；通过 RNA 干扰（RNAi）基因沉默技术研究 ORF5、ORF6 和 ORF8 的功能，并结合 LC-MS/Q-TOF 定量检测 PR 毒素及中间产物 eremofortin A/B 的产量变化。
核心内容
本研究首次对 Penicillium roqueforti 中 PR 毒素生物合成基因簇进行了系统鉴定与功能表征。通过 in silico 分析在 FM164 菌株基因组中定位到约 22.4 kb 的基因簇，包含 11 个开放阅读框，其中 ORF2 编码 aristolochene synthase（ari1）。利用 RNA 干扰技术分别沉默 ORF5、ORF6 和 ORF8（两个 P450 单加氧酶及一个乙酰转移酶），所有转化子的 PR 毒素产量均显著降低：ORF5、ORF6、ORF8 沉默株分别降低 20–32%、23–41% 和 33–41%，对应基因表达分别下降约 1.6 倍、6 倍和 2.6 倍。中间产物分析表明，ORF6 沉默导致 eremofortin A 和 eremofortin B 分别降低 30–40% 和 35–43%，而 ORF5 和 ORF8 沉默导致 eremofortin A 降低 25–45%，但 eremofortin B 反而增加 13–33%。这些结果证实了三个新基因参与 PR 毒素合成，并支持 eremofortin B 作为途径中间体，而 eremofortin A 的角色仍需进一步确证，为完整解析 PR 毒素生物合成途径及菌株改造奠定了基础。
创新点
首次描述了 P. roqueforti 中 22.4 kb 的 PR 毒素生物合成基因簇，包含 11 个开放阅读框；通过基因沉默实验证实了三个新基因（两个 P450 单加氧酶和一个乙酰转移酶）参与 PR 毒素生物合成。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Penicillium roqueforti | PR toxin biosynthesis | ORF1 | Short-chain dehydrogenase/reductase | 催化 | 短链脱氢酶/还原酶，参与 PR 毒素合成 |
| Penicillium roqueforti | PR toxin biosynthesis | ari1 (ORF2) | Aristolochene synthase | 催化 | 倍半萜环化酶，催化 FPP 环化生成 aristolochene |
| Penicillium roqueforti | PR toxin biosynthesis | ORF3 | Quinone oxidase | 催化 | 醌氧化酶，负责 aristolochene 氧化生成 EreB |
| Penicillium roqueforti | PR toxin biosynthesis | ORF4 | Short-chain alcohol dehydrogenase | 催化 | 短链醇脱氢酶，负责 EreA 到 EreC 及后续氧化步骤 |
| Penicillium roqueforti | PR toxin biosynthesis | ORF5 | P450 monooxygenase | 催化 | P450 单加氧酶，沉默后 PR 毒素产量降低 20-32% |
| Penicillium roqueforti | PR toxin biosynthesis | ORF6 | P450 monooxygenase | 催化 | P450 单加氧酶，沉默后 PR 毒素产量降低 23-41%，且 ErmA/ErmB 均下降 |
| Penicillium roqueforti | PR toxin biosynthesis | ORF8 | Acetyltransferase/transferase | 催化 | 乙酰转移酶/转移酶，沉默后 PR 毒素产量降低 33-41% |
| Penicillium roqueforti | PR toxin biosynthesis | ORF9 | P450 monooxygenase | 催化 | 推测的 P450 单加氧酶，参与 PR 毒素合成 |
| Penicillium roqueforti | PR toxin biosynthesis | ORF10 | Fungal transcriptional regulatory protein | 调控 | 推测的转录调控因子，可能调控基因簇转录 |
| Penicillium roqueforti | PR toxin biosynthesis | ORF11 | P450 monooxygenase | 催化 | P450 单加氧酶，在 P. roqueforti 中因提前终止密码子被截短 |
关键发现
- 在 P. roqueforti FM164 基因组中鉴定出约
- 4 kb 的 PR 毒素生物合成基因簇，含 11 个 ORF，其中 ORF2 为 aristolochene synthase（ari1）。对 ORF5（P450 单加氧酶）、ORF6（P450 单加氧酶）和 ORF8（乙酰转移酶）进行 RNAi 沉默后，所有转化子的 PR 毒素产量均显著降低：ORF5 沉默株降低 20-32%，ORF6 沉默株降低 23-41%，ORF8 沉默株降低 33-41%。RT-qPCR 显示基因表达分别降低约
- 6 倍（ORF5）、6 倍（ORF6）和
- 6 倍（ORF8）。中间产物分析表明，ORF6 沉默导致 eremofortin A（ErmA）和 eremofortin B（ErmB）分别降低 30-40% 和 35-43%；ORF5 和 ORF8 沉默导致 ErmA 降低 25-30% 和 40-45%，而 ErmB 反而增加 13-33% 和 13-23%。例外的是转化子 tSorf8-03 中 ErmA 和 ErmB 分别降低 75% 和 90%，可能由 RNAi 脱靶效应导致。
研究结论
本研究首次描述了 P. roqueforti 的 PR 毒素生物合成基因簇，并证实 ORF5、ORF6 和 ORF8 编码的酶确实参与 PR 毒素生物合成。中间产物变化支持 eremofortin B 作为途径中间体，而 eremofortin A 是否作为中间体或副产物仍需进一步研究。研究结果为 PR 毒素生物合成途径的完整解析和菌株选育奠定了基础。