Bacterial Protoplast Fusion: Recombination in Fused Protoplasts of Streptomyces coelicolor
- 作者
- David A. Hopwood, Helen M. Wright
- 单位
- John Innes Institute, Colney Lane, Norwich NR4 7UH, England
- DOI
- 10.1007/BF00268856
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
探索天蓝色链霉菌原生质体融合后基因重组的基本特征，包括亲本基因组是否完整参与交换、能否发生多轮重组以及能否发生多亲本融合。
研究策略
采用PEG诱导原生质体融合，通过六因子杂交的四分析、单菌落分析和四亲本融合实验，系统分析重组子的基因型分布和交换模式。
核心内容
本研究以天蓝色链霉菌A3(2)为对象，采用聚乙二醇诱导原生质体融合，通过六因子杂交的四分析、单菌落分析及四亲本融合实验，系统考察了融合后基因重组的频率、基因组交换完整性与多亲本参与能力。结果显示，六因子杂交中重组频率高达17%，平均为14.4%；DNase处理对重组无显著影响，表明重组不依赖游离DNA。基因型分析表明双交换重组子占76.25%，四交换占23.25%，六交换占0.5%，提示基因组可发生完整或多轮交换。四亲本融合实验中检测到三亲本重组子频率为4.0×10⁻⁴、四亲本为4.9×10⁻⁷，校正后融合群体比例约为44:21:29:6，证明多个原生质体可同时融合并参与重组。单菌落分析中12%的菌落含重组子且无一同时保留两个亲本基因型，进一步支持基因组的完整交换。该工作首次系统证明了链霉菌原生质体融合可实现极高频、近随机且多轮的重组，为放线菌工业菌株和学术菌株的快速构建提供了简便有效的工具。
创新点
首次系统证明链霉菌原生质体融合可产生极高频重组，发现基因组交换是完整的或多轮的，并证实多个原生质体可同时融合参与重组。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces coelicolor A3(2) | — | — | — | 调控 | 底盘细胞，用于原生质体融合和重组分析 |
| Streptomyces coelicolor A3(2) | 脯氨酸合成 | proA1 | — | 催化 | 营养缺陷标记 |
| Streptomyces coelicolor A3(2) | 精氨酸合成 | argA1 | — | 催化 | 营养缺陷标记 |
| Streptomyces coelicolor A3(2) | 嘧啶合成 | uraA1 | — | 催化 | 营养缺陷标记 |
| Streptomyces coelicolor A3(2) | 半胱氨酸合成 | cysD18 | — | 催化 | 营养缺陷标记 |
| Streptomyces coelicolor A3(2) | 组氨酸合成 | hisA1 | — | 催化 | 营养缺陷标记 |
| Streptomyces coelicolor A3(2) | 链霉素抗性 | strA1 | 核糖体蛋白S12 | 调控 | 链霉素抗性标记 |
| Streptomyces coelicolor A3(2) | — | — | lysozyme | 催化 | 用于制备原生质体的细胞壁降解酶 |
关键发现
- 六因子杂交中重组频率高达17%（平均14.4%）
- DNase处理不影响重组频率（4.9×10⁻¹ vs 3.3×10⁻¹）
- 双交换重组子占76.25%，四交换占23.25%，六交换占0.5%
- 四亲本融合中，三亲本重组子频率为4.0×10⁻⁴，四亲本为4.9×10⁻⁷，校正后估算的融合群体比例约为44:21:29:6
- 单菌落分析显示12%菌落含重组子，且无一菌落同时含两个亲本基因型。
研究结论
原生质体融合可导致高频率、近乎随机的重组，涉及完整或接近完整的基因组，且能发生多轮和多亲本重组，为工业及学术菌株构建提供了简便有效的工具。