High-Frequency Electroporation and Maintenance of pUC- and pBR-Based Cloning Vectors in Pseudomonas stutzeri
- 作者
- John M. Pemberton, Robert J. Penfold
- 单位
- Microbiology Department, University of Queensland, St. Lucia, Brisbane, Australia
- 杂志
- Current Microbiology（1992）
- DOI
- 10.1007/BF01570078
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
解决大肠杆菌克隆载体无法直接应用于Pseudomonas stutzeri的问题，实现高频电转化。
研究策略
分离限制性缺陷突变体，优化电穿孔参数（电场强度、时间常数、恢复条件）以提高转化效率。
核心内容
该研究针对大肠杆菌克隆载体无法直接应用于斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）的问题，通过分离限制性缺陷突变体并优化电穿孔参数，建立了高频电转化体系。研究系统考察了电场强度、时间常数及恢复条件对转化效率的影响，首次证明基于ColE1复制子的pUC和pBR系列质粒可在P. stutzeri ATCC 17588中稳定维持，并筛选出限制性缺陷菌株JMP2537。关键结果显示，pHSG298在最优条件下（25 kV/cm、5 ms、200 Ω、25 μF）转化频率高达2×10^7 transformants/μg DNA，而45 kb的大质粒pJP116转化频率为40/μg DNA；在限制性缺陷菌株JMP2537中转化效率较亲本提高20倍，且pJP116经7天连续培养后仍有89%菌落保留质粒。该工作表明P. stutzeri的电穿孔频率可与大肠杆菌氯化钙法相媲美，为直接克隆及高G+C含量基因的异源表达提供了实用工具。
创新点
（1）首次证明ColE1复制子质粒可在P. stutzeri ATCC 17588中维持；（2）分离出限制性缺陷菌株JMP2537；（3）建立高效电穿孔体系，转化频率高达2×10^7/μg DNA。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas stutzeri ATCC 17588 | 质粒维持 | — | — | 区室化 | 野生型菌株，能维持ColE1复制子质粒 |
| Pseudomonas stutzeri JMP2537 | 电穿孔 | — | — | 区室化 | 限制性缺陷突变体，转化效率较亲株提高20倍 |
| Pseudomonas stutzeri | 类胡萝卜素生物合成 | crt基因簇 | — | 催化 | 来自Rhodobacter sphaeroides，表达使菌落呈橙色 |
| Pseudomonas stutzeri | 抗生素抗性 | kan | 氨基糖苷3'-磷酸转移酶 | 催化 | 卡那霉素抗性选择标记，位于pHSG298上 |
关键发现
- pHSG298电穿孔最大转化频率达2×10^7 transformants/μg DNA
- pJP116（45kb）为40/μg DNA
- 限制性缺陷菌株JMP2537较亲株JMP2536提高20倍
- pJP116在JMP2536中经7天连续培养后89%菌落保持质粒（11%为白色Km敏感型）
- 最佳电穿孔条件为25 kV/cm、5ms、200Ω、25μF。
研究结论
P. stutzeri ATCC 17588能维持pUC和pBR系列大肠杆菌克隆载体，其电穿孔频率可与大肠杆菌CaCl2转化法媲美，直接克隆DNA可行，尤其适用于高G+C含量基因的异源表达。