The archaebacterial membrane protein bacterio-opsin is expressed and N-terminally processed in the yeast Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Christine Lang-Hinrichs, Ingo Queck, Georg Bült, Ulf Stahl, Volker Hildebrandt
- 单位
- Technische Universität Berlin, FG Mikrobiologie und Genetik; Freie Universität Berlin, FB Physik, Abt. Biophysik
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（1994）
- DOI
- 10.1007/BF00283521
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
能否在酿酒酵母中异源表达古菌膜蛋白细菌视蛋白（bacterio-opsin），并研究其膜定位、N端加工及功能性色素形成能力。
研究策略
将来自盐杆菌的bop基因（含前导序列或不含前导序列）克隆到2μm多拷贝质粒，由组成型ADH1启动子驱动，在酿酒酵母中表达，通过免疫印迹、膜分级分离和视黄醛加入试验分析表达、定位和加工。
研究路线图
核心内容
该研究将来自盐杆菌的细菌视蛋白基因（bop）克隆至2μm多拷贝质粒，由ADH1组成型启动子驱动，在酿酒酵母中实现了异源表达。无论是否携带13个氨基酸的前导序列，bop基因均能有效转录和翻译，所得蛋白定位于质膜而非细胞质。在AH22菌株中，前体形式被N端加工为与天然成熟蛋白大小一致的产物，加工效率在最小培养基和后期对数生长期更高，而在富培养基中加工不完全；蛋白酶缺陷菌株中仅积累部分加工中间体。然而酿酒酵母中该蛋白表达量仅占总蛋白的约0.01%，明显低于裂殖酵母中的约0.1%，且添加外源视黄醛后无法形成可见的红色细菌视紫红质，表明产量不足以支撑功能性色素组装。该工作首次证明酿酒酵母可作为七螺旋膜蛋白异源表达宿主，且前导序列并非膜靶向必需，为后续利用酵母体系研究膜蛋白折叠与加工提供了基础。
创新点
首次在酿酒酵母中表达细菌视蛋白；证明13个氨基酸的前序列并非膜靶向和插入所必需；发现酿酒酵母能以依赖培养条件的方式对前体进行N端加工。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 异源表达 | bop | Bacterio-opsin | 转运 | 在酿酒酵母中表达并定位于质膜，作为光驱动质子泵，但表达量低，功能性色素形成不足 |
| Schizosaccharomyces pombe | 异源表达 | bop | Bacterio-opsin | 转运 | 对照宿主，能够表达并掺入视黄醛形成功能性细菌视紫红质，细胞呈红色 |
| Halobacterium salinarum | 天然表达 | bop | Bacterio-opsin | 转运 | 天然宿主，用于制备标准品和抗体，作为加工模式参考 |
关键发现
- ['bop基因（前体形式和成熟形式）均能在酿酒酵母中转录和翻译，转录本约1100 nt。', 'BO蛋白在膜部分富集，定位于蔗糖梯度39-41%处，与质膜标记H+-ATPase共分离，细胞质中无BO。', '前体形式BO在AH22菌株中被加工为与天然成熟BO大小相同的蛋白，加工效率在最小培养基和后期对数生长期更高
- 在富含培养基中加工不完全。', '在蛋白酶缺陷菌株cl3-ABYS86中，BO不能完全加工，仅检测到部分加工中间体。', '酿酒酵母中BO表达量约为总蛋白的0.01%，而裂殖酵母中约为0.1%。', '添加all-trans-视黄醛后，酿酒酵母细胞不呈现红色，而裂殖酵母细胞呈红色，说明未能形成足量功能性细菌视紫红质。', '在无视黄醛条件下，酿酒酵母中未观察到显著的C1降解片段，表明BO在该宿主中相对稳定。']
研究结论
酿酒酵母能够表达并N端加工细菌视蛋白，该蛋白正确插入质膜，但表达水平较低，不足以通过外源视黄醛形成可见的功能性细菌视紫红质。前序列并非膜定位所必需，酿酒酵母可作为研究七螺旋膜蛋白表达和加工的宿主。