Functional characterization of Edwardsiella tarda twin-arginine translocation system and its potential use as biological containment in live attenuated vaccine of marine fish
- 作者
- Yamin Wang, Qiyao Wang, Weizheng Yang, Bing Liu, Yuanxing Zhang
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2012）
- DOI
- 10.1007/s00253-012-4462-9
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
阐明迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）双精氨酸转运（Tat）系统的生物学功能，并探索将其作为海洋鱼类减毒活疫苗（LAV）生物遏制系统的可行性。
研究策略
通过基因敲除构建Tat系统缺失突变体（ΔtatABCD），利用报告蛋白ssTorA::GFP验证Tat转运功能；比较表型（H2S产生、溶血活性、应激耐受）和LD50；采用2-DGE结合MALDI-TOF/TOF蛋白质组学鉴定高盐胁迫下差异表达蛋白；在Tat缺失背景下进一步敲除III型分泌系统基因并消除内源质粒pEIB202构建LAV候选株WYM1，评估其在海水中的消除能力及对鱼类的免疫保护效果。
核心内容
该研究以迟缓爱德华氏菌EIB202为对象，系统表征了双精氨酸转运（Tat）系统的功能，并探索将其用作海洋鱼类减毒活疫苗生物遏制模块。通过基因敲除构建ΔtatABCD突变体，报告蛋白ssTorA::GFP证实Tat转运功能缺失；表型比较显示突变体不产H2S、溶血活性减弱，对42℃、SDS、乙醇及4%以上NaCl更敏感，但毒力仅较野生株降低约5倍，说明Tat非体内感染必需。蛋白质组学鉴定到96个差异蛋白，其中高盐胁迫下HemB上调6.62倍，DsbA消失，提示Tat参与周质蛋白折叠与应激响应。在人工海水中ΔtatABCD较野生株更快被抑制，2.5%-4% NaCl条件下完全抑制时间提前3.5-25天。在此基础上构建Tat/TTSS双重缺失并消除内源质粒的疫苗株WYM1，其毒力较野生株降低超10^5倍，注射5×10^3 CFU/g剂量仅6.7%死亡，且在海水约1周完全失活；免疫大菱鲆后攻毒保护率达81.81%（RPS），对照组全部死亡。该研究表明Tat系统与高盐耐受密切相关，Tat突变体可作为盐依赖性生物遏制策略，WYM1兼具高效免疫保护与环境安全性，为海水鱼减毒活疫苗设计提供了新思路。
创新点
首次在E. tarda中系统表征Tat系统的功能，证明其与高盐耐受等应激反应相关；提出并验证Tat突变体作为盐依赖性生物遏制系统的策略，可用于海洋鱼类减毒活疫苗；构建了Tat/TTSS双重缺失、质粒消除的疫苗株WYM1，在保持免疫保护力的同时可在海水环境中快速失活。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Edwardsiella tarda EIB202 | 双精氨酸转运（Tat）系统 | tatA | TatA | 转运 | Tat系统跨膜通道组分，与TatE同源 |
| Edwardsiella tarda EIB202 | 双精氨酸转运（Tat）系统 | tatB | TatB | 转运 | Tat系统组分，参与底物识别 |
| Edwardsiella tarda EIB202 | 双精氨酸转运（Tat）系统 | tatC | TatC | 转运 | Tat系统膜组分，信号肽识别关键蛋白 |
| Edwardsiella tarda EIB202 | 双精氨酸转运（Tat）系统 | tatD | TatD | 转运 | 位于tat操纵子内，但本研究表明其为胞质蛋白，对转运非必需 |
| Edwardsiella tarda EIB202 | 双精氨酸转运（Tat）系统 | tatE | TatE | 转运 | TatA的隐性旁系同源基因，位于染色体其他位置 |
| Edwardsiella tarda EIB202 | 双精氨酸转运（Tat）系统 | ssTorA::gfp | TorA信号肽-GFP融合蛋白 | 转运 | 报告底物，用于检测Tat转运功能 |
| Edwardsiella tarda EIB202 | 双组分调控系统 | esrB | EsrB | 调控 | 调控evpP启动子，控制ssTorA::GFP表达（负对照） |
| Edwardsiella tarda EIB202 | III型分泌系统（TTSS） | eseB, eseC, escA, eseD | TTSS分泌装置组分 | 转运 | 疫苗株WYM1中敲除的毒力相关基因 |
| Edwardsiella tarda EIB202 | 血红素生物合成 | hemB | HemB（δ-氨基乙酰丙酸脱水酶） | 催化 | ΔtatABCD中上调6.62倍，可能受tat操纵子缺失的极性效应影响 |
| Edwardsiella tarda EIB202 | 蛋白质折叠（周质氧化还原） | dsbA | DsbA（周质蛋白二硫键异构酶I） | 催化 | 在ΔtatABCD中消失，可能导致蛋白质折叠异常，影响应激耐受 |
关键发现
- E. tarda Tat系统功能正常，ssTorA::GFP在野生株中成熟转运至周质，在ΔtatABCD中滞留于胞质。
- ΔtatABCD在DHL平板上不产H2S，溶血活性显著减弱；对42℃、SDS、乙醇和高盐（4%、5% NaCl）更敏感。
- 野生株EIB202对斑马鱼LD50为2.5×10^2 CFU/g，对大菱鲆为4.7×10^2 CFU/g；ΔtatABCD毒力仅减弱4.3倍（斑马鱼）和5.2倍（大菱鲆），Tat系统非体内感染必需。
- 2-DGE检测到96个差异蛋白，其中15个鉴定成功（MASCOT>45，变化>2倍）；高盐条件下，HemB上调6.62倍，ETAE_2022上调3.25倍，DsbA消失，SdhB在ΔtatABCD中出现（野生株缺失）。
- 在人工海水（2.5%-4% NaCl）中，ΔtatABCD较EIB202更快被抑制，28℃/16℃/10℃下EIB202完全抑制比ΔtatABCD延迟3.5-5、5-15、4-25天；不可培养细胞100%死亡。
- LAV候选株WYM1（ΔtatABCD、缺失TTSS、消除pEIB202）在鱼体内逐渐清除，注射5×10^3 CFU/g剂量仅6.7%死亡（野生株100%死亡）；在海水约1周完全消除。
- 疫苗试验：WYM1免疫大菱鲆后，攻毒剂量1×10^2 CFU/g，免疫组死亡率18.19%，对照组100%，RPS为81.81%，毒力较野生株降低>10^5倍。
研究结论
Tat系统在E. tarda的高盐应激等生理过程中起重要作用，Tat突变体具有盐依赖性生物遏制的特性，可作为海洋鱼类减毒活疫苗的新型生物遏制系统；构建的WYM1疫苗株高度减毒且能有效保护大菱鲆免受野生株感染，同时在海水中快速失活，提高了环境安全性。