CAROTENOID-BIOSYNTHESIS GENES AS A GENETIC MARKER FOR THE PURPOSE OF GENE CLONING
- 作者
- Shih-Tung Liu
- 单位
- Molecular Genetics Laboratory, Department of Microbiology and Immunology, Chang-Gung Medical College, Kwei-Shan, Taoyuan, Taiwan
- 杂志
- Biochemical and Biophysical Research Communications（1993）
- DOI
- 10.1006/bbrc.1993.2038
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
开发一种简便的克隆载体筛选系统，利用类胡萝卜素生物合成基因产生颜色差异来区分重组子与非重组子，避免使用X-Gal和IPTG等特殊指示剂。
研究策略
将Erwinia herbicola Eho13的类胡萝卜素基因簇部分缺失，使菌落呈粉色（积累番茄红素），并在关键基因中保留多个单一酶切位点，插入外源DNA片段会破坏基因功能导致菌落无色，从而实现视觉筛选。
核心内容
该研究开发了一种基于类胡萝卜素生物合成基因的克隆载体显色筛选系统，旨在替代传统的X-Gal和IPTG指示剂。研究人员将Erwinia herbicola Eho13的类胡萝卜素基因簇部分缺失，使菌落因积累番茄红素而呈粉色，并在关键基因中保留多个单一酶切位点；当外源DNA插入这些位点时，基因功能被破坏，菌落变为无色，从而实现目视筛选。他们构建了7.0 kb的克隆载体pSL775，含ColE1复制起点、氨苄青霉素抗性基因及11个单一克隆位点，转化E. coli后，37°C培养18小时即可清晰区分重组子与非重组子，无需任何特殊底物或诱导剂。该载体在E. coli LE392中约30%的菌落发生缺失而非色素化，显示一定不稳定性。该工作首次用类胡萝卜素基因替代lacZ作为克隆筛选标记，提供了一种简便、低成本且适用于普通LB培养基的通用筛选方法，为后续合成生物学载体设计提供了新思路。
创新点
首次用类胡萝卜素生物合成基因替代lacZ作为克隆载体的显色筛选标记；颜色直接由类胡萝卜素产生，无需底物或诱导剂；适用于多种E. coli菌株和普通LB培养基。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtE | — | 催化 | 参与番茄红素前体合成，缺失导致无色 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtX | — | 催化 | 负责玉米黄素向玉米黄素二葡萄糖苷转化，但在pSL775中非必需 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtY | — | 催化 | 负责番茄红素向β-胡萝卜素转化，其部分缺失导致菌落粉色 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | — | 催化 | 参与八氢番茄红素去饱和反应，插入失活导致无色 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtB | — | 催化 | 参与八氢番茄红素合成，插入失活导致无色 |
关键发现
- 构建了7.0 kb的克隆载体pSL775，含ColE1复制起点和氨苄青霉素抗性基因，具有11个单一克隆位点（Asp718, Aval, BamHI, BanII, EcoRV, HindIII, KpnI, MluI, NcoI, NotI, SmaI）
- 转化E. coli产生粉色克隆，插入DNA片段后菌落无色，37°C培养18小时可目视区分
- pSL525中crt基因簇长6965 bp（GenBank M90698），包含crtEXYIB五个基因
- pSL647缺失1477 bp导致crtY失活并积累番茄红素
- pSL775在E. coli LE392中不稳定，约30%菌落发生缺失而非色素化。
研究结论
成功构建了以类胡萝卜素基因簇为基础的显色克隆载体pSL775，提供了一种无需特殊指示剂的简便克隆筛选方法。