Directed Evolution of Carotenoid Synthases for the Production of Unnatural Carotenoids
- 作者
- Maiko Furubayashi, Daisuke Umeno
- DOI
- 10.1007/978-1-61779-879-5_14
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过定向进化改造类胡萝卜素合成酶，使其能够合成自然界不存在的非天然类胡萝卜素骨架。
研究策略
采用易错PCR随机突变构建酶突变文库，利用大肠杆菌内构建的报告系统进行高通量颜色筛选，筛选出具有新功能的合成酶突变体，并通过组合生物合成拓展产物多样性。
核心内容
该研究利用定向进化策略改造类胡萝卜素合成酶，以获取自然界不存在的非天然类胡萝卜素骨架。研究者对来自金黄色葡萄球菌的C30类胡萝卜素合酶CrtM进行易错PCR随机突变，在大肠杆菌中构建了基于菌落颜色的高通量筛选系统，转化效率超过10⁸转化子/微克质粒，最佳筛选密度控制在每平板小于500个菌落。通过颜色筛选获得一系列CrtM突变体，其中关键氨基酸F26和W38被证实控制链长特异性。将筛选出的CrtM变体与工程化的法尼基二磷酸合酶（FDS）变体（可产生C25前体）共表达，成功合成了具有C45（C25+C20）和C50（C25+C25）骨架的新型类胡萝卜素。该工作表明，定向进化结合颜色筛选能够高效改造类胡萝卜素合成酶，突变酶与非天然前体合酶的组合可系统扩展类胡萝卜素结构多样性，为在微生物中生产非天然萜类化合物提供了通用策略。
创新点
建立了基于菌落颜色的高通量筛选系统；将C30类胡萝卜素合酶CrtM定向进化为能在C40途径中发挥功能的变体；通过工程化FDS与CrtM变体组合，成功合成了C45和C50新型类胡萝卜素骨架。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌（Escherichia coli） | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtM | CrtM | 催化 | 目标进化酶，C30八氢番茄红素合酶，经突变获得在C40途径中发挥功能的能力 |
| 大肠杆菌（Escherichia coli） | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtE | CrtE | 催化 | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶，负责提供C20前体 |
| 大肠杆菌（Escherichia coli） | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtI | CrtI | 催化 | 八氢番茄红素脱氢酶，将无色底物转化为红色番茄红素，用于颜色筛选 |
| 大肠杆菌（Escherichia coli） | 类胡萝卜素生物合成途径 | fds | FDS | 催化 | 来自嗜热脂肪芽孢杆菌的法尼基焦磷酸合酶，被工程化为C25PP合酶，用于延伸碳链 |
关键发现
- 通过易错PCR成功获得CrtM突变体，关键氨基酸F26和W38控制链长特异性
- 突变体与工程化FDS（C25PP合酶）共表达，产生具有C45(C25+C20)和C50(C25+C25)骨架的新型类胡萝卜素
- 筛选系统转化效率超过10^8转化子/μg质粒
- 颜色筛选的最佳菌落密度小于500个/平板。
研究结论
定向进化结合颜色筛选可高效改造类胡萝卜素合成酶，产生的突变酶与非天然前体合酶组合，能够系统性地扩展类胡萝卜素结构的多样性。