DNA Assembler Method for Construction of Zeaxanthin-Producing Strains of Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Zengyi Shao, Yunzi Luo, Huimin Zhao
- DOI
- 10.1007/978-1-61779-918-1_17
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
传统多基因生化通路构建涉及多步克隆（引物设计、PCR、酶切、体外连接、转化等），耗时低效且依赖稀有酶切位点；需要一种一步式、不依赖限制性酶切位点的快速组装方法。
研究策略
利用酿酒酵母体内同源重组机制，先将每个基因的启动子-结构基因-终止子通过重叠延伸PCR（OE-PCR）拼接成单个表达盒，再使各表达盒两端分别与相邻片段及线性化载体具有至少50 bp重叠序列，然后共转化酵母，由体内同源重组一次性将整个通路组装到载体上。
核心内容
该研究提出并验证了一种名为DNA assembler的一步法多基因通路组装技术，旨在替代传统多步克隆的繁琐流程。其核心做法是利用酿酒酵母体内的同源重组机制：先将各基因的启动子、结构基因与终止子通过重叠延伸PCR拼装为表达盒，并在各表达盒及线性化载体之间保留同源重叠序列，随后共转化酵母，由细胞一次性完成整个通路的体内组装。以玉米黄素合成通路为实例，作者成功组装了由crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ五个基因构成的完整通路。结果显示，当组装约25 kb的大片段通路时，使用125 bp的同源重叠序列可使组装效率超过50%，而50 bp重叠时效率仅为10%–20%；整体通路组装平均效率约为80%。通过ScaI与PsiI酶切验证了预期片段大小，并经HPLC在约19.9分钟处检测到玉米黄素标准品信号。该结果表明DNA assembler是一种高效、简便且不依赖限制性酶切位点的通用通路构建方法，可广泛适用于代谢工程与合成生物学中的多基因组装与通路优化。
创新点
提出DNA assembler一步法组装多基因生化通路；无需体外酶切连接，不受限于限制性酶切位点；通过增加同源重叠长度可高效组装大尺寸（如~25 kb）通路；适用于通路工程、组合生物学与合成生物学。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae YSG50 | 玉米黄素生物合成 | crtE | — | 催化 | 来自Erwinia uredovora的类胡萝卜素合成基因 |
| Saccharomyces cerevisiae YSG50 | 玉米黄素生物合成 | crtB | — | 催化 | 来自Erwinia uredovora的类胡萝卜素合成基因 |
| Saccharomyces cerevisiae YSG50 | 玉米黄素生物合成 | crtI | — | 催化 | 来自Erwinia uredovora的类胡萝卜素合成基因 |
| Saccharomyces cerevisiae YSG50 | 玉米黄素生物合成 | crtY | — | 催化 | 来自Erwinia uredovora的类胡萝卜素合成基因 |
| Saccharomyces cerevisiae YSG50 | 玉米黄素生物合成 | crtZ | — | 催化 | 来自Erwinia uredovora的类胡萝卜素合成基因 |
关键发现
- 以玉米黄素（zeaxanthin）合成通路为例，DNA assembler可成功组装由crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ五个基因组成的通路
- 组装~25 kb通路时，使用125 bp同源重叠序列可使组装效率>50%，而50 bp重叠时效率仅为10–20%
- 玉米黄素通路的组装平均效率约80%（随机挑选10个克隆验证）
- ScaI酶切验证预期片段为1,750、2,131、2,628、3,223、5,735 bp，PsiI酶切预期片段为215、1,389、1,689、1,782、2,425、2,752、5,215 bp
- 玉米黄素标准品在HPLC检测中约19.9 min处出峰。
研究结论
DNA assembler是一种高效、简便的一步法构建生化通路的通用方法，避免了传统克隆步骤的繁琐与限制，可广泛应用于代谢工程与合成生物学研究。本文通过玉米黄素通路实例，完整阐述了从DNA制备、酵母转化、克隆验证到产物检测的操作流程。