核心问题：阐明单点突变 L29P 如何将 Pseudomonas fluorescens 酯酶（PFE）从水解酶转变为高效过水解酶，包括其分子机制、动力学极限以及该突变对酯酶活性的影响。
关键发现：L29P 突变使 PFE 的过水解活性提高 70-100 倍：以乙酸为底物时 kcat/Km 从 等 6 条
核心问题：柠檬烯合酶前体蛋白在大肠杆菌中表达量低、易形成包涵体、纯化困难，且其动力学活性低于天然成熟酶；同时需要确定转运肽切割位点并阐明N端双精氨酸对在单萜环化反应中的作用。
关键发现：天然成熟酶对GPP的Km为6.7 μM，kcat为0.024 s⁻¹ 等 7 条
核心问题：如何同时提高嗜热古菌 Sulfolobus solfataricus 酒精脱氢酶（SsADH）的催化活性和热稳定性。
关键发现：['突变体（mSsADH）在65°C下以苯甲醇为底物的比活力为26.1 U/mg，野生型为4.1 U/mg，提高约6倍', '醇底物氧化速率提高约7倍，环己醇氧化速率提高13倍；4-甲氧基苯甲醛还原速率提高6倍', 'NAD+和NADH的解离常数（Kd，25°C，pH 等 3 条
核心问题：如何通过对细胞色素P450cam进行蛋白质工程改造，实现其对结构相关的非天然底物(+)-α-pinene的选择性氧化，生成高附加值的萜类含氧衍生物（如verbenol、verbenone、myrtenol），并提高催化活性和偶联效率。
关键发现：通过对(+)-α-pinene的结构模拟设计P450cam活性位点突变，所有突变体的结合和氧化速率均显著提高。野生型P450cam对(+)-α-pinene的K_D为1.10 μM，产物形成速率18.6 min^-1，偶联效率仅23%。Y96F/V247L双突变体氧化活性最高，达270 nmo...
核心问题：将环阿屯醇合成酶改造成高准确性的羊毛甾醇合成酶，解决产物特异性重塑难题。
关键发现：野生型AthCAS1产生99%环阿屯醇 等 8 条
核心问题：传统P450工程酶的筛选方法无法快速评估其区域选择性，常需耗时费力的HPLC或GC分析，难以高效筛选具有所需选择性的P450催化剂。
关键发现：从~10,000个重组子中筛选出1220个催化活性P450变体（阈值：至少一个探针活性>20%亲本），其中261个（21%）具有独特指纹。对6、8、10的活性预测正确率为87-97%，对7、9、11为90-100% 等 3 条
核心问题：阐明紫杉醇生物合成途径中N-苯甲酰转移酶NDTBT的底物特异性，探索其能否用于生物催化合成新型紫杉烷类似物
关键发现：NDTBT对多种芳酰基CoA的催化效率(Vmax/KM)范围为0.15-1.74 nmol·min^-1·mM^-1 等 2 条
核心问题：OYE家族酶对较大底物催化效率低，且立体选择性单一，难以获得互补的立体异构产物。
关键发现：W116I OYE还原(S)-香芹酮(5)得到trans-7（与野生型所得cis-6为对映体），而还原(R)-香芹酮(3)时所有酶均得trans-4 等 7 条
核心问题：疏水性酮底物在水相中溶解度低，导致酶催化不对称还原通常只能在极低底物浓度（≤5-10 mM）下进行，体积产率不理想；而加入有机溶剂虽可提高溶解度但常导致酶失活，尤其是甲酸脱氢酶（FDH）对有机溶剂敏感。
关键发现：FDH在10% (v/v)正己烷中66-69小时后活性保持92%，20%时保持90% 等 4 条
核心问题：解析酿酒酵母氧化角鲨烯-羊毛甾醇环化酶(ERG7)中Phe699残基的结构-功能关系，并探究单氨基酸替换对环化/重排反应产物特异性的影响。
关键发现：在ERG7F699T突变体中分离得到分子量为426 Da的新化合物，产物特异性>99.8%，该化合物经NMR鉴定为protosta-13(17),24-dien-3β-ol 等 2 条
核心问题：卤醇脱卤酶HheG热稳定性低（在≥40°C时失活），限制了其工业应用，需要提高其热稳定性同时保持或改善催化性能。
关键发现：野生型HheG的表观熔解温度Tm为38°C。共筛选865个变体，14个变体Tm提高至少2°C。T123W、T123Y、T123H的ΔTm为+14°C，T123F为+12°C（原文Table S3未列出具体值但文中提到7-14°C），T123G为+7°C。在环己烯氧化物叠氮化开环反应中，T123... 等 3 条
核心问题：葡萄糖氧化酶(GO)底物范围狭窄且易被H2O2失活，需要寻找具有更宽底物范围和高H2O2稳定性的替代酶，并解决纯化成本高的问题。
关键发现：Y300A在除葡萄糖外所有测试糖（木糖、麦芽糖、纤维二糖、纤维四糖、混合木寡糖）上的活性比GO高最多40倍 等 6 条
核心问题：探索aristolochene合成酶中第334位色氨酸残基在催化过程中稳定eudesmane阳离子中间体、促进aristolochene高效生成的作用机制。
关键发现：野生型AS的Km为2.3±0.5 μM，kcat为0.03±0.01 s⁻¹，催化效率13043±2989 s⁻¹ M⁻¹，产物含~91.5% aristolochene、7.5% germacrene A和0.4% valencene。W334F的Km增至66.8±5.8 μM，kcat降至...
核心问题：aristolochene合酶（AS）中的酪氨酸92（Tyr92）如何控制法尼基焦磷酸（FPP）的环化方向，从而避免生成非环化副产物β-(E)-法尼烯。
关键发现：突变体ASY92V的KM为4.86 μM，kcat为2.51×10^-4 s^-1，催化效率为51.65 M^-1 s^-1 等 3 条
核心问题：解析aristolochone synthase活性位点中Phe178残基在催化FPP环化生成aristolochone过程中的具体功能
关键发现：野生型AS催化产生约92% aristolochone、约8% germacrene A及少量valencene。ASF178Y产物分布类似（86.4% aristolochone、10.7% germacrene A、2.7% valencene），但kcat降低约30倍，KM=5.1 μM... 等 7 条
核心问题：整合P450BM3（CYP102A1）近四十年的研究成果，理清其结构、机制与工程改造策略，以推动该酶在药物代谢产物制备、精细化学品合成和烷烃氧化等领域的应用。
关键发现：['P450BM3分子量约119500 Da，由55 kDa血红素结构域（BMP）和65 kDa还原酶结构域（BMR）融合而成，活性比其他P450脂肪酸羟化酶高至三个数量级。', '以月桂酸（C12）为底物时，不同实验室报道的NADPH消耗速率范围为1.4–86 s⁻¹，表明测定条件影响显著。... 等 4 条
核心问题：比较高度热稳定的工程蛋白酶boilysin（BLN）与thermolysin（TLN）在二肽合成中的催化性能，评估BLN是否可作为TLN在肽合成中的替代酶。
关键发现：BLN在100°C半衰期为170 min，TLN和WT分别为1 min和<0.5 min；在Z-Asp-Phe-OMe合成中，三种酶对L-对映体严格立体选择性，纯D-对映体不反应；NaCl浓度从0增至2.4 M时，初始速率提高3.5倍，但产物产率降低约3倍；温度40、60、70°C时初始速率分... 等 10 条
核心问题：人法尼基二磷酸（FPP）合酶在天然肝组织中含量低且难以大量获得，限制了对其机理、结构和抑制剂的研究。
关键发现：从149 mg粗提物中纯化得到1.8 mg均一重组人FPP合酶融合蛋白，总回收率64%，纯化倍数52倍 等 4 条
核心问题：探究β-内酰胺酶活性位点丝氨酸残基的催化作用，并通过定点突变降低酶活性以捕捉反应中间体
关键发现：S70A突变体对苄青霉素的kcat/Km为200 M^-1·s^-1（约为野生型的0.007%），对氨苄青霉素为120 M^-1·s^-1（0.002%），但几乎不水解6-氨基青霉烷酸、硝基头孢菌素和头孢噻啶。S70C突变体活性最高为硝基头孢菌素2000 M^-1·s^-1（野生型的0.08%...
核心问题：阐明法尼基二磷酸(FPP)合酶中位于第一个天冬氨酸富集基序前第五位氨基酸残基(第81位)如何决定最终产物链长
关键发现：野生型FPP合酶以FPP(C15)为最终产物 等 7 条