Stabilisation of eudesmane cation by tryptophan 334 during aristolochene synthase catalysis†
- 作者
- Athina Deliegorgopoulou, Susan E. Taylor, Silvia Forcat, Rudolf K. Allemann
- 单位
- School of Chemical Sciences, University of Birmingham, Edbaston, Birmingham, UK B15 2TT
- 杂志
- Chemical Communications（2003）
- DOI
- 10.1039/b306867f
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
探索aristolochene合成酶中第334位色氨酸残基在催化过程中稳定eudesmane阳离子中间体、促进aristolochene高效生成的作用机制。
研究策略
通过定点突变将Trp334分别替换为苯丙氨酸(W334F)、亮氨酸(W334L)和缬氨酸(W334V)，在E. coli BL21(DE3)中表达野生型及突变体AS，测定稳态动力学参数，并用GC-MS分析烃类产物的组成。
核心内容
研究者通过定点突变将青霉来源aristolochene合成酶（AS）活性位点的第334位色氨酸分别替换为苯丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸，并在大肠杆菌中异源表达后测定稳态动力学及产物分布。结果表明，野生型AS的催化效率为13043 s⁻¹ M⁻¹，产物中aristolochene占91.5%；而将Trp334替换为脂肪族氨基酸后，W334V和W334L突变体的催化效率分别骤降至约0.3 s⁻¹ M⁻¹和更低，产物几乎全部为germacrene A（W334L达100%），反应停滞于环化早期阶段。即使保留芳香性的W334F突变体，其催化效率也降低约350倍。这首次实验证明，Trp334的吲哚环通过阳离子-π相互作用稳定eudesmane阳离子中间体，是驱动碳正离子重排并高效生成aristolochene的关键；该残基的缺失直接切断了通往终产物的催化通道，揭示了倍半萜环化酶中芳香残基对阳离子中间体精确稳定的重要机制。
创新点
首次实验证明Trp334的吲哚环通过阳离子-π相互作用稳定eudesmane阳离子正电荷，是高效形成aristolochene的关键；用非芳香残基替换后，反应停滞在germacrene A阶段。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源蛋白表达 | 来自Penicillium roqueforti的AS cDNA | aristolochene合成酶(AS)及其突变体W334F/W334L/W334V | 催化 | 作为表达宿主，用于制备野生型和突变体AS进行功能研究 |
| Penicillium roqueforti | 倍半萜生物合成 | aristolochene合成酶基因(AS) | aristolochene合成酶(AS) | 催化 | AS是天然催化FPP环化生成aristolochene的酶 |
| — | FPP环化生成aristolochene途径 | — | Trp334残基（位于AS活性位点） | 调控 | 通过阳离子-π相互作用稳定eudesmane阳离子，调节环化反应进程 |
关键发现
野生型AS的Km为2.3±0.5 μM，kcat为0.03±0.01 s⁻¹，催化效率13043±2989 s⁻¹ M⁻¹，产物含~91.5% aristolochene、7.5% germacrene A和0.4% valencene。W334F的Km增至66.8±5.8 μM，kcat降至2.65×10⁻³ s⁻¹，催化效率降低约350倍，产物含85.5% aristolochene、9.4% germacrene A和4.7% valencene。W334V的Km为33.6±5.2 μM，kcat降至9.15×10⁻⁵ s⁻¹，产物含95.3% germacrene A和4.7% aristolochene。W334L的Km为74.8±17 μM，kcat为2.25×10⁻⁵ s⁻¹，催化效率仅0.3 s⁻¹ M⁻¹，产物100%为germacrene A。
研究结论
Trp334在aristolochene合成酶中通过稳定eudesmane阳离子中间体在产物生成中发挥核心作用：替换为脂肪族氨基酸后，产物几乎全部为germacrene A，证实了该阳离子-π稳定对催化至关重要。