Practical Asymmetric Enzymatic Reduction through Discovery of a Dehydrogenase-Compatible Biphasic Reaction Media
- 作者
- Harald Gröger, Werner Hummel, Stefan Buchholz, Karlheinz Drauz, Tien Van Nguyen, Claudia Rollmann, Hendrik Husken, Kofi Abokitse
- 单位
- Degussa AG, Project House Biotechnology; Institut für Enzymtechnologie der Heinrich-Heine-Universität, Forschungszentrum Jülich; Degussa AG, BU Fine Chemicals
- 杂志
- Organic Letters（2003）
- DOI
- 10.1021/ol0272139
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
疏水性酮底物在水相中溶解度低，导致酶催化不对称还原通常只能在极低底物浓度（≤5-10 mM）下进行，体积产率不理想；而加入有机溶剂虽可提高溶解度但常导致酶失活，尤其是甲酸脱氢酶（FDH）对有机溶剂敏感。
研究策略
筛选对FDH和醇脱氢酶（ADH）均稳定的有机溶剂，构建水/正庚烷（或正己烷）双相反应体系，在较高底物浓度下进行酮的不对称还原，并通过FDH原位再生NADH。
核心内容
该研究针对疏水性酮底物在水相中溶解度低、导致酶催化不对称还原难以在较高底物浓度下进行的问题，开发了一种实用的双相反应体系。作者筛选了对甲酸脱氢酶（FDH）和醇脱氢酶（ADH）均具有良好稳定性的脂肪烃有机溶剂，构建了水/正庚烷（或正己烷）双相介质，在有机溶剂直接存在下实现辅因子NADH的原位再生。研究发现FDH在10%正己烷中66–69小时后活性保持92%，正庚烷比例可达60%仍保持稳定；p-氯苯乙酮在20、40、100和200 mM底物浓度下的转化率分别为77%、75%、74%和63%，对映选择性均超过99%；p-溴苯乙酮转化率65%，ee达97%；苯氧丙酮可定量转化且ee超过99%。该方法首次实现了在有机溶剂存在下、底物浓度高达200 mM的辅因子原位再生不对称酶催化还原，为疏水性酮的不对称还原提供了简便且可放大的方案。
创新点
发现正己烷、正庚烷等脂肪烃溶剂对FDH和ADH具有良好稳定性；首次实现了在有机溶剂直接存在下、底物浓度高达200 mM的辅因子原位再生不对称酶催化还原。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌（E. coli，表达宿主） | 酮的不对称还原 | (S)-醇脱氢酶基因（来自Rhodococcus erythropolis） | (S)-醇脱氢酶（ADH） | 催化 | 在E. coli中表达，具有(S)-对映选择性 |
| 大肠杆菌（E. coli，表达宿主） | 辅因子NADH再生 | 甲酸脱氢酶基因（来自Candida boidinii，突变体C23S, C262A） | 甲酸脱氢酶（FDH） | 能量供给 | 用于原位再生NADH，对有机溶剂敏感但在正己烷/正庚烷中稳定 |
关键发现
- FDH在10% (v/v)正己烷中66-69小时后活性保持92%，20%时保持90%
- 正庚烷比例可达60% (v/v)仍保持稳定。p-氯苯乙酮在底物浓度20、40、100 mM时转化率分别为77%、75%、74%，200 mM时仍达63%，ee均>99%
- p-溴苯乙酮转化率65%，ee 97%
- 苯氧丙酮定量转化，ee>99%。
研究结论
开发了一种实用、高效的不对称酮还原方法，通过使用酶兼容的水/脂肪烃双相介质，在有机溶剂存在下实现了高底物浓度（最高200 mM）的催化反应，同时保持高转化率和对映选择性（最高>99% ee），为疏水性酮的不对称还原提供了简便且可放大的方案。