Truncation of Limonene Synthase Preprotein Provides a Fully Active 'Pseudomature' Form of This Monoterpene Cyclase and Reveals the Function of the Amino-Terminal Arginine Pair†
- 作者
- David C. Williams, Douglas J. McGarvey, Eva J. Katahira, Rodney Croteau
- 单位
- Institute of Biological Chemistry, and Department of Biochemistry and Biophysics, Washington State University, Pullman, Washington 99164-6340
- 杂志
- Biochemistry（1998）
- DOI
- 10.1021/bi980854k
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
柠檬烯合酶前体蛋白在大肠杆菌中表达量低、易形成包涵体、纯化困难，且其动力学活性低于天然成熟酶；同时需要确定转运肽切割位点并阐明N端双精氨酸对在单萜环化反应中的作用。
研究策略
通过系统截短柠檬烯合酶前体蛋白的N端序列，利用pSBET载体补充大肠杆菌稀有精氨酸密码子tRNA，提高可溶性表达；比较各截短体的动力学常数，确定功能最优的'假成熟'形式；通过突变分析双精氨酸对的功能，并结合同源建模解释反应机理。
核心内容
该研究通过系统截短薄荷柠檬烯合酶前体蛋白的N端序列，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中利用pSBET载体补充稀有精氨酸密码子tRNA，成功制备了可溶、易纯化且动力学优于天然酶的“假成熟”酶。结果表明，最佳截短体E57对底物香叶基焦磷酸（GPP）的Km为6.0 μM，kcat为0.034 s⁻¹，催化效率显著高于天然成熟酶（Km=6.7 μM，kcat=0.024 s⁻¹）和前体蛋白（Km=14.9 μM，kcat=0.020 s⁻¹），截短蛋白纯度超过92%，收率超过40%。突变分析揭示，N端双精氨酸对（R58/R59）是单萜合酶独有基序，R59突变后酶丧失将GPP异构化为3S-里哪基焦磷酸（LPP）的能力，但仍能以LPP为底物完成环化生成柠檬烯，表明该精氨酸对专司底物异构化步骤而非环化反应。产物组成均为94%(-)-柠檬烯及少量单萜副产物。该工作解决了柠檬烯合酶异源表达难题，并阐明了单萜环化酶中双精氨酸残基的催化功能，为单萜合酶机制研究和工程改造提供了关键依据。
创新点
成功制备了催化效率高于天然酶的'假成熟'柠檬烯合酶，解决了前体蛋白表达和纯化难题；发现双精氨酸基序是单萜合酶所独有，并证明其参与GPP向LPP的异构化步骤，而非环化步骤。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3)pLysS | — | — | — | — | 宿主细胞，用于表达柠檬烯合酶及各种截短体 |
| — | 单萜生物合成（柠檬烯合成） | limonene synthase cDNA（来自Mentha spicata） | (-)-4S-limonene synthase preprotein | 催化 | 全长前体蛋白，含质体转运肽，表达形成包涵体且动力学受损 |
| — | 单萜生物合成（柠檬烯合成） | 截短的limonene synthase基因（起始于R58） | Pseudomature limonene synthase (R58形式) | 催化 | 最佳截短体，高可溶性，动力学优于天然酶 |
| — | 单萜生物合成（柠檬烯合成） | R59突变体基因 | R59截短体 | 催化 | 不能催化GPP异构化，但能环化外源3S-LPP，证明R58R59参与异构化 |
| — | — | argU基因 | tRNA^Arg4 | 调控 | 编码大肠杆菌稀有精氨酸tRNA，提高富含AGA/AGG的柠檬烯合酶表达 |
关键发现
- 天然成熟酶对GPP的Km为6.7 μM，kcat为0.024 s⁻¹
- 前体蛋白Km为14.9 μM，kcat为0.020 s⁻¹
- 最佳截短体E57的Km为6.0 μM，kcat为0.034 s⁻¹，R58的Km为12.6 μM，kcat为0.037 s⁻¹
- 突变R59丧失GPP异构化能力但能以3S-LPP为底物生成柠檬烯，Km=48.2 μM，kcat=0.105 s⁻¹
- S89几乎无GPP活性但可环化LPP，Km=61.3 μM，kcat=0.017 s⁻¹
- 产物组成均为94%(-)-柠檬烯及少量月桂烯、α-蒎烯和β-蒎烯
- 截短蛋白纯度>92%，收率>40%。
研究结论
截短N端转运肽可获得高度可溶、易纯化且动力学优于天然酶的假成熟柠檬烯合酶；双精氨酸残基对于底物GPP的异构化形成LPP是不可或缺的，而对后续环化反应非必需；研究为单萜合酶的结构与机制提供了新见解。