An N-Aroyltransferase of the BAHD Superfamily Has Broad Aroyl CoA Specificity in Vitro with Analogues of N-Dearoylplacitaxel
- 作者
- Danielle M. Nevarez, Yemane A. Mengistu, Irosha N. Nawarathne, Kevin D. Walker
- 单位
- Department of Chemistry, Cell and Molecular Biology Program, and Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, East Lansing, Michigan 48824
- 杂志
- Journal of the American Chemical Society（2009）
- DOI
- 10.1021/ja900545m
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明紫杉醇生物合成途径中N-苯甲酰转移酶NDTBT的底物特异性，探索其能否用于生物催化合成新型紫杉烷类似物
研究策略
在大肠杆菌中重组表达并纯化NDTBT，与多种合成的芳酰基CoA和烷酰基/烯酰基CoA供体以及三种N-脱苯甲酰基紫杉烷受体进行体外酶反应，利用UV-HPLC和LC-ESI-MS/MS检测和定量产物
核心内容
该研究在大肠杆菌中重组表达并纯化了紫杉醇生物合成途径中的N-苯甲酰转移酶NDTBT，系统考察了其以多种芳酰基、杂环酰基及烷酰基/烯酰基CoA为供体、三种N-脱苯甲酰紫杉烷为受体的体外催化活性。通过UV-HPLC和LC-ESI-MS/MS检测发现，该酶具有极为宽泛的酰基CoA底物特异性，对多种非天然芳酰基CoA的催化效率范围为0.15–1.74 nmol·min⁻¹·mM⁻¹，其中4-甲基苯甲酰CoA的效率与天然底物苯甲酰CoA相当；以N-脱苯甲酰紫杉醇为受体时，2-呋喃酰CoA的相对速率高达200%，3-甲氧基苯甲酰CoA为85%，而3-呋喃酰CoA仅19%。进一步实验揭示，受体C2'羟基的存在显著改变酰基供体偏好：对2'-羟基化受体，己酰CoA的相对速率可达100%并超过苯甲酰CoA，而脱氧受体对乙酰CoA和己酰CoA的相对速率分别为47%和36%。结果表明NDTBT是一种通用酰基转移酶，其底物结构微扰可显著影响催化动力学，该酶有望作为生物催化剂制备新型紫杉烷类抗癌药物，并为BAHD超家族底物选择性研究提供参考。
创新点
首次揭示NDTBT具有极为宽泛的酰基CoA底物特异性，包括多种非天然芳酰基和烷酰基；发现C2'羟基的存在改变了酰基供体偏好；采用高灵敏度MS/MS方法检测低丰度产物；提出NDTBT可作为生物催化剂制备新型紫杉烷
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3) | 紫杉醇生物合成途径 | ndtbt | NDTBT (N-debenzoyl-2'-deoxypaclitaxel N-benzoyltransferase) | 催化 | 该酶在紫杉醇生物合成中催化N-脱苯甲酰-2'-脱氧紫杉醇的N-苯甲酰化；本研究用于底物特异性分析 |
| Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3) | — | ndtbt | His6-NDTBT融合蛋白 | 催化 | 重组表达载体pET28a，用于表达纯化重组NDTBT |
关键发现
- NDTBT对多种芳酰基CoA的催化效率(Vmax/KM)范围为0.15-1.74 nmol·min^-1·mM^-1
- 其中4-甲基苯甲酰CoA的效率(1.7 nmol·min^-1·mM^-1)与天然底物苯甲酰CoA(1.6)相当。以N-脱苯甲酰紫杉醇为受体时，2-呋喃酰CoA的相对速率高达200%（苯甲酰CoA为100%），3-甲氧基苯甲酰CoA为85%，而3-呋喃酰CoA为19%。以N-脱苯甲酰-2'-脱氧紫杉醇为受体时，乙酰CoA和己酰CoA的相对速率分别为47%和36%，丁酰CoA和丁烯酰CoA分别为3%和2%。此外，对于2'-羟基化的N-脱苯甲酰紫杉醇，烷酰基CoA的转移速率超过苯甲酰CoA，如己酰CoA的相对速率达100%等。总相对速率范围约1%-200%。
研究结论
NDTBT是一个通用酰基转移酶，具有广阔的底物特异性，能转移多种芳酰基、杂环酰基和烷酰基/烯酰基到N-脱苯甲酰紫杉烷上，且底物结构微扰影响其动力学。该酶可望用于生物催化合成新型紫杉烷类抗癌药物，并为BAHD超家族底物选择性的研究提供参考。