Active-site serine mutants of the Streptomyces albus G β-lactamase
- 作者
- Francoise JACOB, Bernard JORIS, Jean-Marie FRERE
- 单位
- Centre d'Ingénierie des Protéines and Laboratoire d'Enzymologie, Institut de Chimie B6, Université de Liège, Sart-Tilman, 4000 Liège, Belgium
- 杂志
- Biochemical Journal（1991）
- DOI
- 10.1042/bj2770647
- 所属领域
- 酶工程
- 关键词
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解决的核心问题
探究β-内酰胺酶活性位点丝氨酸残基的催化作用，并通过定点突变降低酶活性以捕捉反应中间体
研究策略
通过定点突变将活性位点丝氨酸(Ser70)分别替换为丙氨酸(S70A)和半胱氨酸(S70C)，在变铅青链霉菌中异源表达、纯化，并对其动力学参数、pH依赖性、热稳定性和与抑制剂相互作用进行表征
核心内容
该研究通过定点突变将变铅青链霉菌来源的β-内酰胺酶活性位点丝氨酸（Ser70）分别替换为丙氨酸（S70A）和半胱氨酸（S70C），并在变铅青链霉菌中异源表达、纯化，系统表征了突变体的动力学、pH依赖性、热稳定性及抑制剂反应性。结果显示，S70A对苄青霉素的kcat/Km约为200 M⁻¹·s⁻¹，相当于野生型的0.007%，但对多种其他底物几乎无活性；S70C的活性在酸性pH下反而升高，与野生型相反，其最高活性见于硝基头孢菌素（约2000 M⁻¹·s⁻¹，为野生型的0.08%），且可被2-巯基乙醇显著激活。两个突变体在45℃的热稳定性均低于野生型。研究还发现S70A制剂中约含五万分之一的野生型污染，并证实β-碘青霉烷酸处理能有效消除这类污染。这些结果表明，丝氨酸残基对催化至关重要，突变虽大幅降低甚至几乎消除活性，但仍保留了极低的特异性活性，反映出该类酶共价催化的高效率，并为捕获反应中间体提供了可行途径。
创新点
1. 构建了S70A和S70C突变体并纯化；2. 发现S70A突变体虽活性极低但保留特异性活性；3. 揭示S70C活性在酸性pH下增加，与野生型相反；4. 通过β-碘青霉烷酸处理有效消除因误译产生的野生型污染
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces albus G | β-内酰胺水解 | — | 野生型β-内酰胺酶 | 催化 | 野生型酶，活性位点丝氨酸为Ser70 |
| Streptomyces lividans TK24 | β-内酰胺水解 | — | S70A β-内酰胺酶 | 催化 | 活性位点丝氨酸突变为丙氨酸 |
| Streptomyces lividans TK24 | β-内酰胺水解 | — | S70C β-内酰胺酶 | 催化 | 活性位点丝氨酸突变为半胱氨酸 |
关键发现
S70A突变体对苄青霉素的kcat/Km为200 M^-1·s^-1（约为野生型的0.007%），对氨苄青霉素为120 M^-1·s^-1（0.002%），但几乎不水解6-氨基青霉烷酸、硝基头孢菌素和头孢噻啶。S70C突变体活性最高为硝基头孢菌素2000 M^-1·s^-1（野生型的0.08%），其kcat/Km值在pH 7不超过野生型的0.1%，且在酸性pH下活性增加。S70C对β-碘青霉烷酸的kcat/Km约1 M^-1·s^-1，与野生型180000 M^-1·s^-1相比降低显著。热稳定性方面，S70C和S70A在45℃半衰期分别为35±5和25±5分钟，野生型为55分钟。S70A制剂中约有1/50000的野生型污染。S70C的活性可被2-巯基乙醇激活20倍以上。
研究结论
活性位点丝氨酸突变体均保留低但可检测的活性，其中S70A对青霉素类有微弱活性，S70C活性总体下降但特异性谱改变。共价催化在该类酶中极为高效。