Synthesis of cambratriene-ol and cambratriene-diol in yeast via the MVA pathway
- 作者
- Yu Zhang, Shiquan Bian, Xiaofeng Liu, Ning Fang, Chunkai Wang, Yanhua Liu, Yongmei Du, Michael P. Timko, Zhongfeng Zhang, Hongbo Zhang
- 单位
- TRI of CAAS-UVA Joint Laboratory of Synthetic Biology, Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China; Department of Biology, University of Virginia, 485 McCormick Road, Charlottesville, VA 22904, USA
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2021）
- DOI
- 10.1186/s12934-021-01523-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
烟草西松烷类化合物（CBT-ol和CBT-diol）是否可通过甲羟戊酸（MVA）途径在酵母中合成，以及该途径用于微生物合成西松烷类化合物的可行性
研究策略
将烟草西松烷合酶CBTS1及CYP450基因进行密码子优化并在酵母中表达，利用N端AD/BD结构域作为翻译前导序列提高蛋白表达水平；在强化MVA途径及GGPP供给的酵母工程菌BY-T20中实现CBT-ol和CBT-diol的异源合成，并通过摇瓶和生物反应器发酵测定产量
核心内容
该研究在酿酒酵母中建立了基于甲羟戊酸途径的烟草西松烷类化合物异源合成体系。通过密码子优化烟草西松烷醇合酶基因CBTS1并融合GAL4激活结构域作为N端翻译前导序列，在强化GGPP供给的工程菌株BY-T20中成功实现了西松烷醇的合成，而在未强化前体供给的BY4742和BY-T1菌株中则无法检测到产物。摇瓶发酵总产量约1.56 mg/L，补料分批生物反应器发酵72小时产量达10.02 mg/L，湿菌体超过50 g/L。进一步共表达CBTS1与细胞色素P450羟化酶基因，实现了CBT-diol的合成，摇瓶总产量约0.15 mg/L，生物反应器中达1.05 mg/L。研究发现200 μM CBT-diol对灰霉菌具有强烈抑制作用，但对酿酒酵母生长无可见抑制，表明酵母对该类化合物不敏感。这一结果首次证明酵母MVA途径可用于西松烷类化合物的微生物合成，为烟草来源抗真菌二萜化合物的绿色生产提供了可行策略。
创新点
首次在酵母中通过MVA途径成功合成烟草西松烷类化合物CBT-ol和CBT-diol；发现N端AD融合标签可显著提高CBTS1在酵母中的表达；证明酵母对CBT-ol/CBT-diol不敏感，可作为合成宿主
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | MVA途径 | — | — | 调控 | 野生型酵母菌株，用于测试CBT-ol/CBT-diol的敏感性及作为低GGPP供给对照 |
| Saccharomyces cerevisiae BY-T1 | MVA途径 | tHMG1 | 截短HMG-CoA还原酶 | 催化 | 表达tHMG1以增强MVA上游碳通量，但GGPP供给仍不足，未能合成CBT-ol |
| Saccharomyces cerevisiae BY-T20 | MVA途径/GGPP合成 | tHMG1, BTS1-ERG20, SaGGPS | HMG-CoA还原酶、法尼基焦磷酸合酶/香叶基香叶基焦磷酸合酶融合蛋白、 Sulfolobus acidocaldarius GGPPS | 催化 | 高效生产GGPP的工程菌株，成功实现CBT-ol和CBT-diol合成 |
| Saccharomyces cerevisiae BY-T20 | 西松烷合成 | CBTS1 (GenBank: AAS46038.1) | 西松烷醇合酶CBTS1 | 催化 | 催化GGPP生成CBT-ol；以AD-CBTS1融合蛋白形式表达 |
| Saccharomyces cerevisiae BY-T20 | 西松烷合成 | CYP450 (GenBank: AF166332) | 细胞色素P450羟化酶 | 催化 | 催化CBT-ol羟化生成CBT-diol；以BD-CYP450融合蛋白形式表达 |
| Saccharomyces cerevisiae BY-T20 | 蛋白表达调控 | GAL4 AD (activation domain) | GAL4转录激活结构域 | 调控 | 作为N端翻译前导序列提高CBTS1蛋白表达水平 |
| Saccharomyces cerevisiae BY-T20 | 蛋白表达调控 | GAL4 BD (DNA binding domain) | GAL4 DNA结合结构域 | 调控 | 作为N端翻译前导序列提高CYP450蛋白表达水平 |
关键发现
- 在BY-T20菌株中表达AD-CBTS1可合成CBT-ol，而在BY4742和BY-T1中无法检测到
- 摇瓶培养1 L时，CBT-ol在细胞中产量为692.73 μg/L，培养液中为863.95 μg/L，总产量约1.56 mg/L
- 生物反应器72 h发酵CBT-ol产量达10.02 mg/L，湿菌体超过50 g/L。共表达AD-CBTS1和BD-CYP450后，摇瓶培养CBT-diol总产量约0.15 mg/L，其中α-CBT-diol在细胞中13.72 μg/L、培养液中50.10 μg/L，β-CBT-diol在细胞中13.05 μg/L、培养液中72.76 μg/L
- 生物反应器CBT-diol产量达1.05 mg/L。200 μM CBT-diol强烈抑制灰霉菌（Botrytis cinerea）生长，但对酿酒酵母生长无可见抑制
研究结论
酵母对烟草抗真菌化合物CBT-ol和CBT-diol不敏感，可作为西松烷类化合物的合成宿主；本研究证明了通过MVA途径进行西松烷类化合物生产的可行性，为微生物合成烟草西松烷类化合物提供了新的生物方法