Efficient and scalable synthesis of 1,5-diamino-2-hydroxy-pentane from L-lysine via cascade catalysis using engineered Escherichia coli
- 作者
- Yangyang Li, Alei Zhang, Shewei Hu, Kequan Chen, Pingkai Ouyang
- 单位
- College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 211816, China; State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 211816, China
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2022）
- DOI
- 10.1186/s12934-022-01864-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
目前2-OH-PDA生产仅通过纯酶催化实现，难以放大；底物转运速率、催化环境（pH、温度、离子）和分离方法限制其高效合成。
研究策略
构建工程化大肠杆菌BL21(DE3)，采用两阶段全细胞催化：第一阶段共表达赖氨酸3-羟化酶K3H和赖氨酸转运蛋白（CadB和ArgT）将L-赖氨酸转化为(2S,3S)-3-羟基赖氨酸；第二阶段用表达CadA脱羧酶的细胞将羟基赖氨酸转化为2-OH-PDA。优化反应条件，并在5L发酵罐中采用补料策略进行放大。
核心内容
本研究构建了工程化大肠杆菌BL21(DE3)，通过两阶段全细胞催化实现从L-赖氨酸高效合成1,5-二氨基-2-羟基戊烷（2-OH-PDA）。第一阶段共表达赖氨酸3-羟化酶K3H与赖氨酸转运蛋白CadB和ArgT，将L-赖氨酸转化为(2S,3S)-3-羟基赖氨酸；第二阶段利用表达脱羧酶CadA的细胞将羟基赖氨酸转化为目标产物。研究发现共表达CadB和ArgT使羟基赖氨酸产量较对照菌株提高2.1倍，达13.9 g/L；四种脱羧酶中CadA活性最高。在5 L发酵罐中采用连续补料策略，最终获得110.5 g/L羟基赖氨酸和80.5 g/L 2-OH-PDA，摩尔产率62.6%，产物纯度95.6%，回收率70.3%。该两阶段全细胞催化策略克服了纯酶催化难以放大的瓶颈，通过优化底物转运和反应条件实现了目前报道的最高产量，为2-OH-PDA的绿色工业化生产提供了可行方案。
创新点
首次利用工程化大肠杆菌全细胞双阶段催化从L-赖氨酸合成2-OH-PDA；发现共表达CadB和ArgT转运蛋白显著提高羟基赖氨酸产量；筛选出最优脱羧酶CadA；实现了目前最高的2-OH-PDA产量（80.5 g/L）和95.6%纯度。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | L-赖氨酸羟化（Fe(II)/α-酮戊二酸依赖性） | K3H | L-lysine 3-hydroxylase K3H | 催化 | 催化L-赖氨酸转化为(2S,3S)-3-羟基赖氨酸 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 羟基赖氨酸脱羧 | CadA | L-lysine/hydroxylysine decarboxylase CadA | 催化 | 四种脱羧酶中活性最高，用于第二阶段脱羧 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 羟基赖氨酸脱羧 | SrdA | Hydroxylysine decarboxylase SrdA | 催化 | 相对活性98.5%，仅次于CadA |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 羟基赖氨酸脱羧 | CpdA | Hydroxylysine decarboxylase CpdA | 催化 | 相对活性50.6% |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 羟基赖氨酸脱羧 | FjdA | Hydroxylysine decarboxylase FjdA | 催化 | 相对活性1.1%，活性极低 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | L-赖氨酸转运 | cadB | CadB (lysine/cadaverine antiporter) | 转运 | 赖氨酸/尸胺反向转运蛋白，促进赖氨酸吸收，共表达可提高羟基赖氨酸产量 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | L-赖氨酸转运 | argT | ArgT (lysine-binding periplasmic protein) | 转运 | ABC转运系统的底物结合蛋白，促进赖氨酸吸收，共表达提高产量 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | L-赖氨酸转运 | lysP | LysP (lysine-specific permease) | 转运 | 赖氨酸特异性通透酶，单独过表达时产量较低 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | L-赖氨酸转运 | ybjE | YbjE (putative lysine exporter) | 转运 | 假定赖氨酸分泌蛋白，参与赖氨酸外排 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | L-赖氨酸转运 | hisQ | HisQ (ABC transporter permease) | 转运 | ABC转运蛋白通透酶组分，参与赖氨酸吸收，单独过表达产量低于对照 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | L-赖氨酸转运 | hisM | HisM (ABC transporter permease) | 转运 | ABC转运蛋白通透酶组分，参与赖氨酸吸收 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | L-赖氨酸转运 | hisP | HisP (ABC transporter ATP-binding protein) | 转运 | ABC转运蛋白ATP结合组分，水解ATP供能，但静息细胞中ATP供给不足 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | L-赖氨酸转运 | argO | ArgO (lysine exporter) | 转运 | 赖氨酸分泌蛋白，参与赖氨酸外排 |
关键发现
- 双阶段全细胞催化优于单阶段；共表达CadB和ArgT的菌株B14使羟基赖氨酸产量较B1提高2.1倍（B1为13.9 g/L）；在5L发酵罐中，采用连续补料策略（策略3）获得110.5 g/L羟基赖氨酸和80.5 g/L 2-OH-PDA，摩尔产率62.6%，产物纯度95.6%，回收率70.3%；四种脱羧酶中CadA活性最高（相对活性100%，SrdA
- 5%，CpdA
- 6%，FjdA
- 1%）；添加0.1 mM PLP可显著提高脱羧产量（无PLP时仅为0.05 mM时的35%）；最佳羟化条件为pH
- 0、30°C，最佳脱羧温度为50-60°C。
研究结论
所提出的两阶段全细胞催化是一种绿色、高效且可规模化的2-OH-PDA生产方法，具有工业应用前景。