Increasing ATP turnover boosts productivity of 2,3-butanediol synthesis in Escherichia coli
- 作者
- Simon Boecker, Björn-Johannes Harder, Regina Kutscha, Stefan Pflügl, Steffen Klamt
- 单位
- Max Planck Institute for Dynamics of Complex Technical Systems; Institute for Chemical, Environmental and Bioscience Engineering, Research Area Biochemical Engineering, Technische Universität Wien
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2021）
- DOI
- 10.1186/s12934-021-01554-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
2,3-丁二醇（2,3-BDO）生产菌株在产量和生产率上仍需提升，特别是生长耦联生产中存在生长与产量之间的权衡，以及生长停滞细胞代谢活性低的问题。
研究策略
通过过表达F1-ATPase的atpAGD基因强制增加ATP消耗（ATP wasting），结合代谢网络改造使ATP合成与2,3-BDO合成耦联，从而提升底物摄取和产物合成速率；并设计三阶段培养工艺实现高生产率和相对高产量的结合。
核心内容
该研究在大肠杆菌中通过过表达F1-ATPase的atpAGD基因强制增加ATP消耗，并将ATP合成与2,3-丁二醇（2,3-BDO）合成途径耦联，以破解生长与产量之间的权衡。作者构建了表达budA、budB、budC合成2,3-BDO并敲除副产物途径的菌株，在此基础上过表达atpAGD，考察了有氧、微好氧及氮限制生长停滞等不同条件下的生产性能，并设计了三阶段培养工艺。结果显示，在有氧生长耦联条件下，ATPase菌株的特异性葡萄糖摄取率较对照提高50%以上（从7.52增至11.24 mmol/(gDW·h)），2,3-BDO合成率提高约2倍，但生长率减半。在氮限制生长停滞条件下，葡萄糖摄取率达9.26 mmol/(gDW·h)，为对照的6倍以上，2,3-BDO合成率提高10倍。微好氧条件下产率达0.87 mol/mol，为理论最大值的87%。三阶段工艺中，ATPase菌株总产率为0.75 mol/mol葡萄糖，比对照高23%，体积生产率为1.44 mmol/(L·h)，为对照的2.25倍。该工作证明强制ATP浪费可有效提升非生长细胞的底物摄取和产物合成速率，为生长解耦联生产提供了新思路。
创新点
['首次将强制ATP浪费策略应用于异源2,3-BDO生产，显著提升生长耦联和生长解耦联条件下的产物合成速率。', '揭示了有氧、微好氧及生长停滞条件下的产量-生产率权衡，并提出了三阶段培养新策略，避免微好氧条件同时获得高产量和高生产率。', '获得的非生长E. coli细胞特异性葡萄糖摄取率9.26 mmol/(gDW·h)为当时报道的最高值。']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli 445_Ediss Δ4 | 2,3-丁二醇合成途径 | budA, budB, budC | α-乙酰乳酸脱羧酶、α-乙酰乳酸合酶、2,3-丁二醇脱氢酶 | 催化 | 异源表达，使E. coli W具备2,3-BDO合成能力 |
| Escherichia coli 445_Ediss Δ4 | ATP代谢/能量代谢 | atpAGD | F1-ATPase（胞内ATP水解酶部分） | 能量供给 | 过表达以强制ATP消耗，提高ATP周转 |
| Escherichia coli 445_Ediss Δ4 | 副产物发酵途径 | ldhA, adhE, pta, ffdA | 乳酸脱氢酶、乙醇脱氢酶、磷酸转乙酰酶、富马酸还原酶（推测） | 调控 | 敲除以阻断副产物生成，使ATP合成与2,3-BDO合成耦联 |
关键发现
- ['在生长耦联有氧条件下，ATPase菌株的特异性葡萄糖摄取率比对照提高>50%（从7.52增至11.24 mmol/(gDW·h)），2,3-BDO特异性合成率提高约2倍（从1.52增至3.18 mmol/(gDW·h)），2,3-BDO产率从0.20增至0.29 mol/mol，但生长率减半（μ从0.42降至0.20 h⁻¹），体积生产率降低50%。', '在有氧氮限制生长停滞条件下，ATPase菌株葡萄糖摄取率为9.26 mmol/(gDW·h)，是对照（1.28）的6倍以上；2,3-BDO特异性合成率提高10倍（3.58 vs
- 32 mmol/(gDW·h)），体积生产率提高4倍（0.94 vs
- 18 mmol/(L·h)）。', '在微好氧氮限制条件下，ATPase菌株2,3-BDO产率达到0.87 mol/mol（0.44 g/g葡萄糖），为E. coli在葡萄糖最低培养基中的最高报道值，比对照（0.70）提高24%，葡萄糖摄取率提高62%。', '三阶段过程中，ATPase菌株在第二阶段（有氧生长停滞）的特异性2,3-BDO合成率为3.60 mmol/(gDW·h)，体积生产率为2.23 mmol/(L·h)，远高于对照（0.18和0.15）。第三阶段（厌氧）伴随乙偶姻消耗时，特异性合成率高达10.14 mmol/(gDW·h)，总体积生产率达6.18 mmol/(L·h)。', '三阶段整体过程（0-25.42 h）中，ATPase菌株总体2,3-BDO产率为0.75 mol/mol葡萄糖，比对照（0.61）高23%，总体积生产率为1.44 mmol/(L·h)，是对照（0.64）的2.25倍；完成90%以上葡萄糖消耗的时间为25.4 h，而对照需要48 h。', 'ATPase菌株在微好氧条件下2,3-BDO产率0.87 mol/mol，为理论最大值的87%。', '非生长E. coli细胞中9.26 mmol/(gDW·h)的葡萄糖摄取率是迄今报道的最高值。']
研究结论
强制ATP浪费是一种有效的代谢工程策略，能显著提高E. coli中2,3-BDO的产率和生产率，尤其在生长解耦联的生产阶段效果显著。三阶段工艺可结合高生产率与相对高产量，且ATPase菌株性能优于对照。未来可通过优化ATPase表达水平进一步改善菌株性能。