High-flux isobutanol production using engineered Escherichia coli: a bioreactor study with in situ product removal
- 作者
- Antonino Baez, Kwang-Myung Cho, James C. Liao
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2011）
- DOI
- 10.1007/s00253-011-3173-y
- 所属领域
- 代谢工程/发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
在大肠杆菌中实现异丁醇的高产量生产，并解决产物毒性限制最终效价的问题。
研究策略
将摇瓶工艺放大至1 L生物反应器，采用气提进行原位产物移除，比较高产菌株JCL260、耐受菌株SA481和亲本JCL16的异丁醇生产性能，并结合酶活测定分析温度对生产的影响。
核心内容
该研究将大肠杆菌异丁醇生产从摇瓶放大至1 L生物反应器，并采用气提进行原位产物移除，以克服产物毒性对最终效价的限制。实验比较了高产菌株JCL260、异丁醇耐受菌株SA481和亲本JCL16的生产性能，并结合酶活测定评估了温度的影响。结果显示，JCL260在30°C下72小时内总异丁醇产量达50.8±1.1 g/L，JCL16为41.4±4.5 g/L，而耐受菌株SA481仅产23±4.4 g/L，表明耐受性并未转化为生产优势。JCL260的体积产率为0.7 g/L/h，葡萄糖转化率为0.29 g/g，达到理论最大值的68%。相比之下，37°C下产量降低了53%，且AdhA酶活性下降是主要原因之一。这些结果证明气提原位产物移除能有效解除产物抑制，使大肠杆菌异丁醇效价突破50 g/L，同时提示温度调控和醇脱氢酶活性优化对进一步提升产量至关重要。
创新点
首次利用气提原位产物回收在生物反应器中使大肠杆菌异丁醇产量超过50 g/L；发现异丁醇耐受菌株SA481在生产中并不占优，表明原位产物移除可克服产物毒性；揭示了37°C下AdhA活性下降是产量降低的原因之一。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JCL260 | 异丁醇生物合成途径 | alsS | 乙酰乳酸合酶 AlsS | 催化 | 来自枯草芽孢杆菌，由pSA69质粒过表达 |
| Escherichia coli JCL260 | 异丁醇生物合成途径 | ilvC | 酮醇酸还原异构酶 IlvC | 催化 | 由pSA69质粒过表达 |
| Escherichia coli JCL260 | 异丁醇生物合成途径 | ilvD | 二羟酸脱水酶 IlvD | 催化 | 由pSA69质粒过表达 |
| Escherichia coli JCL260 | 异丁醇生物合成途径 | kivd | 2-酮异戊酸脱羧酶 KivD | 催化 | 来自乳酸乳球菌，由pSA65质粒过表达 |
| Escherichia coli JCL260 | 异丁醇生物合成途径 | adhA | 醇脱氢酶 AdhA | 催化 | 由pSA65质粒过表达 |
| Escherichia coli JCL260 | 副产物形成途径 | adhE | 乙醇脱氢酶 | 催化 | 敲除基因，减少乙醇形成 |
| Escherichia coli JCL260 | 副产物形成途径 | frdBC | 富马酸还原酶 | 催化 | 敲除基因，减少琥珀酸形成 |
| Escherichia coli JCL260 | 转录调控 | fnr | 富马酸硝酸盐还原调控因子 | 调控 | 敲除基因，减少厌氧相关代谢 |
| Escherichia coli JCL260 | 副产物形成途径 | ldhA | 乳酸脱氢酶 | 催化 | 敲除基因，减少乳酸形成 |
| Escherichia coli JCL260 | 副产物形成途径 | pta | 磷酸转乙酰酶 | 催化 | 敲除基因，减少乙酸形成 |
| Escherichia coli JCL260 | 副产物形成途径 | pflB | 丙酮酸甲酸裂解酶 | 催化 | 敲除基因，减少甲酸形成 |
| Escherichia coli JCL260 ΔpoxB | 乙酸代谢 | poxB | 丙酮酸氧化酶 | 催化 | 敲除基因，进一步减少乙酸积累 |
关键发现
- JCL260在30°C、72 h内产生总异丁醇50.8±1.1 g/L；JCL16为41.4±4.5 g/L；SA481在68 h内仅23±4.4 g/L。发酵液中最大异丁醇浓度：JCL260和JCL16约11 g/L，SA481约6.5 g/L。JCL260在30°C下体积产率为0.7 g/L/h，比Clostridium beijerinckii BA101在类似系统中的1-丁醇产率高93%。最大异丁醇产率对葡萄糖为0.29±0.003 g/g，为理论最大值的68%。37°C下异丁醇产量比30°C低53%。最大细胞浓度：JCL16
- 4±0.3 g/L，SA481
- 6±0.7，JCL260
- 7±0.16 g/L。乙酸最大浓度在生长阶段：JCL260
- 8±0.8 g/L，JCL16
- 5±2.6，SA481
- 5±0.5 g/L；22 h时JCL16和JCL260分别为13.7±2.6和7.1±3.6 g/L。
研究结论
气提原位产物移除能有效克服异丁醇毒性，显著提高大肠杆菌异丁醇效价至50 g/L以上；异丁醇耐受菌株并未带来生产优势；30°C比37°C更适合异丁醇生产，且AdhA活性是关键限制因素。