Efficient functional analysis system for cyanobacterial or plant cytochromes P450 involved in sesquiterpene biosynthesis
- 作者
- Hisashi Harada, Kazutoshi Shindo, Kanoko Iki, Ayuko Teraoka, Sho Okamoto, Fengnian Yu, Jun-ichiro Hattan, Ryutaro Utsumi, Norihiko Misawa
- 单位
- Central Laboratories for Frontier Technology, Kirin Holdings Co. Ltd., i-BIRD, Suematsu, Nonoichi-machi, Ishikawa 921-8836, Japan; Department of Food and Nutrition, Japan Women's University, Mejirodai, Bunkyo-ku, Tokyo 112-8681, Japan; Department of Bioscience, Graduate School of Agriculture, Kinki University, Nakamachi, Nara 631-8505, Japan; Research Institute for Bioresources and Biotechnology, Ishikawa Prefectural University, 1-308, Suematsu, Nonoichi-machi, Ishikawa 921-8836, Japan
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2011）
- DOI
- 10.1007/s00253-010-3062-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在异源宿主中鉴定参与倍半萜生物合成的细胞色素P450功能时，产物量往往不足以进行结构鉴定，且缺乏合适的氧化还原伴侣系统。
研究策略
构建携带甲羟戊酸利用基因簇和多种氧化还原伴侣基因的pAC-Mv系列质粒，在E. coli中与目标倍半萜合酶和P450基因共表达，通过GC-MS和NMR分析鉴定产物。
核心内容
该研究针对异源宿主中鉴定参与倍半萜生物合成的细胞色素P450时产物量不足、缺乏适配氧化还原伴侣的瓶颈，构建了携带甲羟戊酸利用基因簇及多种来源氧化还原伴侣基因的pAC-Mv系列质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中与目标倍半萜合酶和P450基因共表达，利用GC-MS和NMR鉴定产物结构。研究中从生姜克隆了新的NADPH-P450还原酶ZoRED1和ZoRED2。在CYP71BA1功能分析中，含pAC-Mv ZoRED1的菌株使8-羟基-α-蛇麻烯产量达0.443 mg/L，为对照的2.3倍，α-蛇麻烯产量达37.756 mg/L；首次鉴定了蓝藻P450NS（CYP110C1）的功能，在NsRED/NsFER组合下产物水平比CamA/CamB高2.9倍，转化率5.2%对1.8%，产物1经鉴定为1,2,3,5,6,7,8,8a-octahydro-6-isopropenyl-4,8a-dimethylnaphth-1-ol。该研究建立了适用于蓝藻和植物P450的高效功能分析系统，为倍半萜生物合成途径中P450酶的鉴定提供了有效工具。
创新点
构建了pAC-Mv系列质粒，包含来自蓝藻、细菌和植物的多种氧化还原伴侣；从生姜中克隆了新的NADPH-P450还原酶ZoRED1和ZoRED2；首次鉴定了蓝藻P450NS（CYP110C1）的功能，并确定了其产物结构。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径 | mevalonate pathway gene cluster (mvaK, mvaD, mvaK2, idi) | MVA kinase, phosphomevalonate kinase, diphosphomevalonate decarboxylase, IPP isomerase | 催化 | 来自Streptomyces sp. strain CL190；HMG-CoA还原酶和合酶被移除 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径 | idi (type 2) | IPP isomerase | 催化 | 来自Streptomyces sp. strain CL190，催化IPP与DMAPP互变 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | camA, camB | putidaredoxin reductase (CamA), putidaredoxin (CamB) | 能量供给 | 来自Pseudomonas putida；细菌I类P450的氧化还原伴侣 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | NsRED, NsFER | ferredoxin reductase (NsRED), ferredoxin (NsFER) | 能量供给 | 来自Nostoc sp. strain PCC 7120；蓝藻I类P450的氧化还原伴侣 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | ATR2 | NADPH-P450 reductase (ATR2) | 能量供给 | 来自Arabidopsis thaliana；截短形式，去掉膜锚定 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | ZoRED1 | NADPH-P450 reductase (ZoRED1) | 能量供给 | 来自Zingiber officinale；新分离 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | ZoRED2 | NADPH-P450 reductase (ZoRED2) | 能量供给 | 来自Zingiber officinale；新分离 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | NS1 (alr4685) | germacrene A synthase (NS1) | 催化 | 来自Nostoc sp. strain PCC 7120 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | P450NS (CYP110C1, alr4686) | germacrene A hydroxylase (P450NS) | 催化 | 来自Nostoc sp. strain PCC 7120；功能在本研究中鉴定 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | ZSS1 | α-humulene synthase (ZSS1) | 催化 | 来自Zingiber zerumbet |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 倍半萜生物合成 | CYP71BA1 | α-humulene hydroxylase (CYP71BA1) | 催化 | 来自Zingiber zerumbet |
关键发现
- 在CYP71BA1功能分析中，使用IPTG诱导时，含pAC-Mv质粒的E. coli产生8-羟基-α-蛇麻烯的水平是对照的1.5-2.3倍（pAC-Mv ATR2:
- 291 mg/L
- 5倍；pAC-Mv ZoRED1:
- 443 mg/L
- 3倍；pAC-Mv ZoRED2:
- 405 mg/L
- 1倍；对照pSTV28-ATR2:
- 193 mg/L）；α-蛇麻烯产量在pAC-Mv ZoRED1下达37.756 mg/L（对照0.925 mg/L）。P450NS产物水平在NsRED/NsFER组合下比CamA/CamB高2.9倍，转化率分别为5.2%和1.8%。产物1被鉴定为1,2,3,5,6,7,8,8a-octahydro-6-isopropenyl-4,8a-dimethylnaphth-1-ol（分子式C15H24O）。
研究结论
该研究建立了一个适用于蓝藻和植物P450的高效功能分析系统，可有效鉴定参与倍半萜生物合成的P450酶。