Bioconversion of substituted naphthalenes and β-eudesmol with the cytochrome P450 BM3 variant F87V
- 作者
- Norihiko Misawa, Miho Nodate, Toshihiko Otomatsu, Keiko Shimizu, Chie Kaido, Miho Kikuta, Akira Ideno, Hiroshi Ikenaga, Jun Ogawa, Sakayu Shimizu, Kazutoshi Shindo
- 单位
- Marine Biotechnology Institute (MBI), Heita, Kamaishi, Iwate 026-0001, Japan; Central Laboratories for Frontier Technology, Kirin Holdings Co. Ltd., i-BIRD, 3-570, Suematsu, Nonoichi-machi, Ishikawa 921-8836, Japan; KNC Bio Research Center, KNC Laboratories Co., Ltd, 1-1-1, Murodani, Nishi-ku, Kobe 651-2241, Japan; Department of Food and Nutrition, Japan Women's University, Mejirodai, Bunkyo-ku, Tokyo 112-8681, Japan; Division of Applied Life Sciences, Graduate School of Agriculture, Kyoto University, Sakyo-ku, Kyoto 606-8502, Japan; Research Institute for Bioresources and Biotechnology, Ishikawa Prefectural University, Nonoichi-machi, Ishikawa 921-8836, Japan
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2010）
- DOI
- 10.1007/s00253-010-3064-7
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
化学法难以在惰性碳原子上进行羟基化，细胞色素P450可催化该反应但稳定性差且需要电子传递蛋白；本研究旨在通过融合古菌PPlase提高P450 BM3 (F87V)在E. coli中的可溶性和稳定性，并利用该酶及PAH双加氧酶将多种取代萘和β-桉叶醇转化为高价值羟基化衍生物。
研究策略
将Thermococcus sp. KS-1的FKBP型PPlase与P450 BM3 (F87V) N端融合，构建pFusionF87V质粒在E. coli中表达；同时利用Cycloclasticus sp. A5的PhnA1A2A3A4双加氧酶转化取代萘生成顺式二氢二醇，经10% HCl/甲醇脱水获得单羟基化产物；对各产物进行HPLC、质谱和NMR鉴定。
核心内容
本研究将来自古菌Thermococcus sp. KS-1的FKBP型肽脯氨酰顺反异构酶（PPlase）与细胞色素P450 BM3突变体F87V进行N端融合，在E. coli中实现了该单加氧酶的可溶表达与热稳定性提升。融合酶经60°C热处理20分钟后仍保留43.9%的活性，显著高于未融合对照的27.7%。以表达该融合酶的全细胞催化多种取代萘的区域选择性羟基化，获得系列单羟基化产物，包括1-甲基萘转化为4-甲基萘-1-醇（产率6.3%），2-甲基萘生成6-甲基萘-1-醇（6.6%），以及1-乙氧基萘经氧化芳基偶联形成新化合物4,4'-二乙氧基-[2,2']-联萘-1,1'-二醇（3.3%）；倍半萜β-桉叶醇亦被转化为5-羟基-β-桉叶醇。同时利用Cycloclasticus sp. A5的PhnA1A2A3A4双加氧酶转化取代萘产生顺式二氢二醇，经酸脱水可高效获得酚类产物，如2-甲基萘生成7-甲基萘-1-醇（产率52%）。该融合策略为P450酶在工业生物转化中的应用提供了可行方案，结合双加氧酶路径可拓展高价值羟基化萘衍生物的制备途径，为药物合成提供新原料。
创新点
['首次将古菌FKBP型PPlase与P450 BM3 (F87V)融合，显著提高其可溶性和热稳定性', '首次报道P450 BM3 (F87V)对多种取代萘（如甲氧基、乙氧基、甲基、二甲基等）的羟基化活性', "从1-乙氧基萘生物转化获得新化合物4,4'-二乙氧基-[2,2']-联萘-1,1'-二醇（8），推测经氧化芳基偶联生成", '实现P450 BM3 (F87V)对倍半萜β-桉叶醇的区域和立体选择性羟基化，生成5-羟基-β-桉叶醇', '将PhnA1A2A3A4双加氧酶产生的顺式二氢二醇酸脱水，与P450产物互补获得多种单羟基萘衍生物']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | P450单加氧酶羟基化 | cytochrome P450 BM3 (F87V) gene (CYP102A1 variant) | Cytochrome P450 BM3 F87V | 催化 | 催化取代萘和β-桉叶醇的羟基化；与古菌PPlase融合表达 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 蛋白折叠辅助 | FKBP-type PPIase gene from Thermococcus sp. KS-1 (AB012209) | FKBP型肽脯氨酰顺反异构酶 (PPlase) | 调控 | 作为N端融合伴侣，发挥分子伴侣作用，提高P450 BM3 (F87V)的可溶性和热稳定性 |
| Escherichia coli JM109 | PAH双加氧酶羟基化 | phnA1, phnA2, phnA3, phnA4 genes from Cycloclasticus sp. A5 | PhnA1A2A3A4多组分PAH-双羟基化双加氧酶 | 催化 | 催化取代萘生成顺式二氢二醇，经10% HCl/甲醇脱水生成单羟基萘衍生物 |
关键发现
- 融合PPlase的P450 BM3 (F87V)在E. coli中主要以可溶形式表达，60°C热处理20 min后剩余活性为43.9%±14.3%，优于未融合的27.7%±3.0%。用E. coli (pFusionF87V)转化多种取代萘，均获得单羟基化产物（分离产率）：1-甲基萘→4-甲基萘-1-醇(6.3%)和萘-1-甲醇(5.3%)
- 2-甲基萘→2-甲基萘-1-醇(4.0%)和6-甲基萘-1-醇(6.6%)
- 1,4-二甲基萘→(4-甲基萘-1-基)甲醇(5.0%)
- 1,6-二甲基萘→4,7-二甲基萘-1-醇(3.6%)
- 1-甲氧基萘→4-甲氧基萘-1-醇(3.5%)
- 1-乙氧基萘→新化合物4,4'-二乙氧基-[2,2']-联萘-1,1'-二醇(3.3%)
- α-甲基-1-萘甲醇→5-(1-羟基乙基)萘-1-醇(4.8%)
- 1-萘甲酸甲酯→5-羟基萘-1-甲酸甲酯(3.0%)。类似地，E. coli (pHnA)的PhnA1A2A3A4双加氧酶产生顺式二氢二醇，酸处理后得到多种酚类产物，如2-甲基萘→7-甲基萘-1-醇(52%)等。此外，β-桉叶醇被P450 BM3 (F87V)羟基化为5-羟基-β-桉叶醇。
研究结论
研究表明，将古菌FKBP型PPlase与P450 BM3 (F87V)融合能显著提高其可溶性表达和热稳定性，该融合酶可催化多种取代萘及β-桉叶醇的区域/立体选择性羟基化，显示出广泛的底物接受性；结合PhnA1A2A3A4双加氧酶及其酸脱水策略，可制备多种单羟基化萘衍生物，为药物筛选等提供化合物来源。