Biosynthesis of polyhydroxyalkanoate copolymers from methanol by Methylobacterium extorquens AM1 and the engineered strains under cobalt-deficient conditions
- 作者
- Izumi Orita, Kouta Nishikawa, Satoshi Nakamura, Toshiaki Fukui
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s00253-013-5490-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何以甲醇为唯一碳源，通过代谢工程使甲基营养菌Methylobacterium extorquens AM1合成具有实用价值的聚羟基脂肪酸酯（PHA）共聚物，而非仅合成均聚物P(3HB)。
研究策略
利用钴缺乏条件下乙基丙二酰-CoA（EMC）途径中丙酰-CoA的积累来驱动3HV单体的合成；通过替换PHA合酶基因（phaC）为广底物特异性的phaC_Ac实现3HHx掺入；敲除pccA增强3HV比例；敲除dep基因尝试阻断PHA降解；过表达phaAB增强PHA积累。
核心内容
该研究以甲醇为唯一碳源，通过代谢工程改造甲基营养菌Methylobacterium extorquens AM1，旨在实现聚羟基脂肪酸酯（PHA）共聚物的生物合成，而非仅生成均聚物P(3HB)。研究利用钴缺乏条件下乙基丙二酰-CoA（EMC）途径中丙酰-CoA的积累驱动3HV单体掺入，并替换PHA合酶基因（phaC_Ac）以引入广底物特异性，同时通过敲除pccA增强3HV比例、过表达phaAB提升PHA积累。结果显示，野生型在Co²⁺缺乏下可合成含1–6 mol% 3HV的P(3HB-co-3HV)共聚物；phaC_Ac替换菌株AM1C_Ac的PHA含量达32.6 wt%，约为野生型（8.4 wt%）的4倍，并合成了含0.28 mol% 3HHx的三元共聚物。敲除pccA使两阶段培养中3HV比例从0.27 mol%提升至77.7 mol%；过表达phaAB使PHA含量提高1.4倍（至43.6 wt%）、3HV比例提升约7倍（至3.23 mol%）。该研究证实EMC途径可为PHA共聚物提供丙酰-CoA和丁酰-CoA前体，为以甲醇为原料的甲基营养菌生产实用PHA共聚物奠定了基础。
创新点
首次发现钴缺乏条件下野生型M. extorquens AM1能以甲醇为唯一碳源合成P(3HB-co-3HV)共聚物；首次通过基因工程改造甲基营养菌显著提高甲醇依赖的PHA产量并合成P(3HB-co-3HV-co-3HHx)三元共聚物；证实EMC途径可为PHA合成提供丙酰-CoA和丁酰-CoA前体。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Methylobacterium extorquens AM1 | PHA生物合成途径 | phaC_Me | PHA合酶（PhaC_Me） | 催化 | 原始PHA合酶，催化3HB-CoA聚合为P(3HB) |
| Methylobacterium extorquens AM1 | 乙基丙二酰-CoA（EMC）途径 | pccA | 丙酰-CoA羧化酶α亚基 | 催化 | 敲除后导致丙酰-CoA积累，3HV比例升高 |
| Methylobacterium extorquens AM1 | PHA生物合成途径 | phaA | β-酮硫解酶（PhaA） | 催化 | 催化乙酰-CoA与丙酰-CoA缩合形成3HV-CoA前体 |
| Methylobacterium extorquens AM1 | PHA生物合成途径 | phaB | NADPH-乙酰乙酰-CoA还原酶（PhaB） | 催化 | 催化3-酮酰基-CoA还原，过表达提高PHA含量和3HV比例 |
| Methylobacterium extorquens AM1C_Ac | PHA生物合成途径 | phaC_Ac | PHA合酶（PhaC_Ac，来自Aeromonas caviae） | 催化 | 广底物特异性PHA合酶，使3HHx掺入、PHA含量提高 |
| Methylobacterium extorquens AM1C_Ac | PHA降解途径 | depA | PHA解聚酶DepA | 催化 | 单敲除无显著表型，与depB/depC三敲除后仍无显著影响 |
| Methylobacterium extorquens AM1C_Ac | PHA降解途径 | depB | PHA解聚酶DepB | 催化 | 单敲除无显著表型 |
| Methylobacterium extorquens AM1C_Ac | PHA降解途径 | depC | PHA解聚酶DepC | 催化 | 本研究新发现的第三个假定胞内PHA解聚酶基因（Mex_1p4148） |
| Methylobacterium extorquens AM1 | 乙基丙二酰-CoA（EMC）途径 | ccr | 巴豆酰-CoA还原酶/羧化酶（Ccr） | 催化 | EMC途径关键酶，可能提供丁酰-CoA用于3HHx合成 |
| Methylobacterium extorquens AM1 | 甲醇氧化与同化（丝氨酸循环/EMC途径） | mxaF | 甲醇脱氢酶 | 催化 | 其启动子用于过表达phaAB |
关键发现
- 野生型AM1在Co²⁺缺乏条件下（1-6 mol% 3HV）合成P(3HB-co-3HV)；phaC_Ac替换菌株AM1C_Ac PHA含量为32.6 wt%，是野生型（8.4 wt%）的约4倍，并合成含0.28 mol% 3HHx的三元共聚物；pccA敲除使两阶段培养中甲醇阶段新合成PHA的3HV比例从0.27 mol%提高到77.7 mol%；过表达phaAB使PHA含量提高1.4倍（至43.6 wt%）、3HV比例提高约7倍（至3.23 mol%），但残渣细胞质量减半；野生型PHA的Mn为0.66×10⁵，PDI
- 1；AM1C_Ac的PHA Mn为1.2×10⁵，PDI
- 1；depABC三敲除对生长和PHA积累无显著影响；AM1C_Ac中PHA合酶活性低于野生型（<3 mU/mg vs 30 mU/mg）。
研究结论
M. extorquens AM1在钴缺乏条件下能够以甲醇为唯一碳源合成PHA共聚物，通过替换PHA合酶和调控EMC途径可产生含3HV和3HHx的共聚酯；EMC途径是提供PHA共聚物前体的潜在平台，该研究为以甲醇为原料的甲基营养菌生产实用PHA共聚物开辟了可能性。