Metabolic engineering of Escherichia coli to enhance hydrogen production from glycerol

作者: Kien Trung Tran, Toshinari Maeda, Thomas K. Wood
杂志: Applied Microbiology and Biotechnology（2014）
DOI: 10.1007/s00253-014-5600-3
所属领域: 代谢工程
关键词: Anaerobic fermentationEscherichia coliGlycerolHydrogenMetabolic engineering
阅读原文: 查看 PDF 原文

解决的核心问题

以甘油为底物时，此前从葡萄糖产氢的工程菌株效果不佳（氢气产量仅提高1.8倍且生长减慢），需要重新设计大肠杆菌代谢网络，通过靶向基因敲除增强甘油产氢。

研究策略

系统筛选与氢代谢及甘油代谢相关的14个单基因敲除菌株，确定有益基因敲除；通过P1转导逐级组合敲除，构建多基因缺失菌株；结合低分压发酵进一步优化产氢和细胞生长。

研究路线图

100%

下载 .drawio 源文件

核心内容

针对以甘油为底物时原有产氢工程菌效果不佳的问题，该研究系统筛选了大肠杆菌中与氢代谢及甘油代谢相关的14个单基因敲除菌株，发现10个有益于甘油产氢的敲除靶点，其中aceE敲除效果最显著，氢气产量达62±3 μmol/mg protein，提高2.1倍。随后通过P1转导逐级组合敲除，构建出七基因缺失菌株（ΔfrdC ldhA fdnG ppc narG mgsA hycA），使氢气产量达到158±2 μmol/mg protein，为野生型（28.8±0.3 μmol/mg protein）的5.5倍，并在48小时实现1 mol H2/mol glycerol的理论最大产氢率，而野生型120小时仅达0.88 mol H2/mol glycerol。其中mgsA敲除阻断甲基乙二醛合成为首次报道。进一步结合低分压发酵，工程菌的氢气产率提升至6.9±0.3 mmol/g cell/h（野生型为2.2±0.2 mmol/g cell/h），细胞生长速率提高2倍以上。该研究为利用甘油厌氧发酵高效生物制氢提供了有效的代谢工程策略，证明组合敲除与发酵条件优化可协同突破产氢瓶颈。

创新点

发现10个有益于甘油产氢的单基因敲除；构建七基因敲除菌株（frdC, ldhA, fdnG, ppc, narG, mgsA, hycA），使氢气产量提高5.5倍并达到理论最大产氢量；首次报道敲除mgsA阻断甲基乙二醛合成可增强大肠杆菌产氢。

研究对象（18）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Escherichia coli BW25113	厌氧呼吸/富马酸还原	frdC	富马酸还原酶C亚基	催化	单敲除提高氢气产量1.6倍，被纳入最优多敲除菌株
Escherichia coli BW25113	乳酸发酵	ldhA	D-乳酸脱氢酶	催化	单敲除提高氢气产量1.1倍，被纳入最优多敲除菌株
Escherichia coli BW25113	甲酸氧化	fdnG	甲酸脱氢酶N α亚基	催化	单敲除提高氢气产量1.3倍，被纳入最优多敲除菌株
Escherichia coli BW25113	PEP羧化	ppc	磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶	催化	单敲除提高氢气产量1.4倍，被纳入最优多敲除菌株
Escherichia coli BW25113	硝酸盐呼吸	narG	硝酸还原酶A α亚基	催化	单敲除提高氢气产量1.1倍，被纳入最优多敲除菌株
Escherichia coli BW25113	甲基乙二醛合成	mgsA	甲基乙二醛合酶	催化	首次报道其敲除增强产氢，单敲除提高1.2倍，被纳入最优多敲除菌株
Escherichia coli BW25113	FHL途径调控	hycA	FHL复合物阻遏蛋白	调控	单敲除提高氢气产量1.2倍，被纳入最优多敲除菌株
Escherichia coli BW25113	甲酸转运	focA	甲酸转运蛋白	转运	单敲除提高氢气产量1.1倍，但与其它有益敲除组合时降低产氢
Escherichia coli BW25113	氢代谢	hyaB	氢化酶1大亚基	催化	单敲除提高氢气产量1.1倍，但与其它有益敲除组合时降低产氢
Escherichia coli BW25113	丙酮酸代谢	aceE	丙酮酸脱氢酶E1p亚基	催化	单敲除提高氢气产量2.1倍，但与其它有益敲除组合时降低产氢
Escherichia coli BW25113	氢代谢	hybC	氢化酶2大亚基	催化	单敲除完全消除产氢，故不用于多敲除菌株
Escherichia coli BW25113	甲酸氧化	fdoG	甲酸脱氢酶O α亚基	催化	单敲除对产氢无明显提升（0.96倍）
Escherichia coli BW25113	丙酮酸代谢	poxB	丙酮酸氧化酶	催化	单敲除降低产氢（0.6倍）
Escherichia coli BW25113	乙醇发酵	adhE	乙醇脱氢酶/乙醛脱氢酶	催化	单敲除消除产氢
Escherichia coli BW25113	甘油代谢	gldA	甘油脱氢酶	催化	过表达未提高产氢，但与其他策略联用可能有益
Escherichia coli BW25113	甘油代谢	dhaKLM	二羟丙酮激酶	催化	过表达二羟丙酮激酶与甘油脱氢酶可改善甘油利用
Escherichia coli BW25113	FHL途径	fdhF	甲酸脱氢酶H亚基	催化	过表达未提高产氢
Escherichia coli BW25113	FHL途径调控	fhlA	FHL复合体转录激活因子	调控	过表达未提高产氢

关键发现

最佳七基因敲除菌株（BW25113ΔfrdC ldhA fdnG ppc narG mgsA hycA）的氢气产量为158±2 μmol/mg protein，是野生型（28.8±0.3 μmol/mg protein）的5.5倍
氢气产率达到理论最大值1 mol H2/mol glycerol（48 h），而野生型120 h仅0.88 mol H2/mol glycerol。低分压发酵下，工程菌H2产率为6.9±0.3 mmol/g cell/h（野生型2.2±0.2 mmol/g cell/h），H2产量为0.70±0.1 mmol/mmol glycerol（野生型0.19 mmol/mmol glycerol），细胞生长速率提高2倍以上。单基因敲除中，aceE敲除效果最显著（62±3 μmol/mg protein，提高2.1倍），frdC、ppc、fdnG等也分别提高1.6、1.4、1.3倍。

研究结论

通过系统的单基因筛选和组合敲除，七基因敲除菌株在甘油厌氧发酵中达到理论最大氢气产量，结合低分压发酵可显著提高生长速率和产氢效率，为利用甘油生物制氢提供了高效的代谢工程策略。