Production of (+)-valence in the mushroom-forming fungus S. commune
- 作者
- Karin Scholtmeijer, Katarina Cankar, Jules Beekwilder, Han A. B. Wösten, Luis G. Lugones, Dirk Bosch
- 单位
- Department of Microbiology, Kluyver Centre for Genomics of Industrial Fermentation, Utrecht University, Padualaan 8, 3584 CH Utrecht, The Netherlands; Laboratory of Plant Physiology, Wageningen University and Research Centre, Droevendaalsesteeg 1, 6708 PB Wageningen, The Netherlands; Plant Research International, Wageningen University and Research Centre, Droevendaalsesteeg 1, 6709 PB Wageningen, The Netherlands; Department of Chemistry, Utrecht University, Padualaan 8, 3584 CH Utrecht, The Netherlands; Platform Green Synthetic Biology, Delft University of Technology, Julianalaan 67, 2628 BC Delft, The Netherlands
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1007/s00253-014-5581-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
探索蘑菇形成真菌裂褶菌（Schizophyllum commune）作为倍半萜（+）-缬草烯生产平台的潜力，同时解决野生型菌株分泌大量裂褶菌多糖（schizophyllan）导致产物难以分离纯化的问题。
研究策略
在裂褶菌中异源表达来自诺特卡扁柏的缬草烯合成酶基因（CnVS），采用密码子优化并构建含与不含酵母Cox IV线粒体靶向信号的表达载体；利用thn突变体（RGS蛋白基因被转座子破坏）减少胞外多糖分泌；以正十二烷作为有机覆盖层原位萃取产物，并通过GC-MS定量。
核心内容
该研究在蘑菇形成真菌裂褶菌中异源表达缬草烯合成酶基因CnVS，首次在担子菌中实现倍半萜（+）-缬草烯的生产。研究者通过密码子优化构建含或不含酵母Cox IV线粒体靶向信号的表达载体，并利用thn突变体消除胞外裂褶菌多糖分泌，同时以正十二烷作为有机覆盖层原位萃取产物。结果显示，表达CnVS的转化株最高产量达16.6 mg/L培养液，thn突变体的产量比野生型转化株高约4倍，且正十二烷回收率从野生型的10%提升至60-70%。不含线粒体靶向信号的载体产量比含MTS的载体高3.5-4.5倍。时间进程实验表明，thn突变体转化株在葡萄糖耗竭后产量仍持续增加。研究还发现（+）-缬草烯可非酶促转化为少量（+）-圆柚酮，且重组子实体能释放（+）-缬草烯至顶空。该工作证明裂褶菌可作为倍半萜生产的有效平台，thn突变体策略通过消除多糖污染显著改善了产物萃取效率，结合代谢工程手段有望进一步提升产量。
创新点
['首次在蘑菇形成真菌（担子菌）中实现外源倍半萜（+）-缬草烯的生产。', '利用thn突变体显著提高产物产量和正十二烷萃取效率（回收率从10%提高到60-70%）。', '发现（+）-缬草烯在裂褶菌培养物中可非酶促转化为（+）-圆柚酮。', '证明（+）-缬草烯可在子实体中产生并释放到顶空。']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Schizophyllum commune (H4-8) 和 KS8 thn突变体 | 甲羟戊酸（MEV）通路（FPP合成） | erg10, erg13, hmgr, erg12, erg8, erg19, erg20 | 甲羟戊酸通路酶类 | 催化 | 基因组中鉴定到同源基因，且MPSS和RNA-seq数据表明在野生型中均有表达 |
| Schizophyllum commune (H4-8 和 KS8) | 倍半萜生物合成 | CnVS (GenBank JX040471) | 缬草烯合成酶 | 催化 | 来自诺特卡扁柏，经裂褶菌密码子优化后异源表达 |
| Schizophyllum commune (KS8) | G蛋白信号转导 | thn (GenBank AF267870) | RGS蛋白 | 调控 | thn基因被scooter-2转座子破坏导致突变，影响生长、多糖分泌及次级代谢 |
| Schizophyllum commune (H4-8 和 KS8) | 倍半萜生物合成（线粒体靶向） | Cox IV MTS-CnVS 融合基因 | 酵母Cox IV线粒体靶向信号+缬草烯合成酶 | 区室化 | 尝试将缬草烯合成酶靶向线粒体，但未提高产量 |
关键发现
- 野生型菌株H4-8的裂褶菌多糖产量为2.9±0.7 g/L，而thn突变体KS8中该多糖未检测到
- KS8生物量为3.9±0.2 g/L，低于野生型的9.0±1.5 g/L。表达CnVS的转化株中，（+）-缬草烯的最高产量达16.6 mg/L培养液
- thn突变体（KS8）的产量比野生型转化株高约4倍
- 不含线粒体靶向信号的pESCT-V质粒比含MTS的pESCT-MV产量高3.5-4.5倍。正十二烷回收率方面，野生型转化株仅回收约10%的添加量，而KS8转化株可回收60-70%，相当于提高了6-7倍。时间进程实验显示，KS8转化株T206.2在葡萄糖耗竭（第7天）后，（+）-缬草烯产量仍持续增加至第10天，最高达9.5±0.4 mg/L。在产量最高的菌株中检测到少量（+）-圆柚酮（10-15 μg/mL），且通过热灭活对照实验表明该转化是非酶促的。子实体顶空分析中，重组子实体释放（+）-缬草烯的量为4.6±2.7 μg/皿/24h，折合每克子实体16.9±5.5 μg/24h
- 同时检测到痕量圆柚酮和β-榄香烯（germacrene A的热重排产物）。
研究结论
裂褶菌可作为倍半萜类化合物生产的有效平台，异源表达缬草烯合成酶可获得最高16.6 mg/L的（+）-缬草烯；利用thn突变体不仅能提高产量，还能通过消除裂褶菌多糖大幅改善有机溶剂萃取效率。将该策略与MEV途径强化或FPP竞争途径弱化等代谢工程手段结合，有望进一步提升产量。