Expression in Pichia pastoris and characterization of two novel dirigent proteins for atropselective formation of gossypol
- 作者
- Isabelle Effenberger, Michael Harport, Jens Pfannstiel, Iris Klaiber, Andreas Schaller
- 单位
- Institute of Plant Physiology and Biotechnology, University of Hohenheim; Core Facility Hohenheim, Mass Spectrometry Unit, University of Hohenheim
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s00253-016-7997-3
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
解决dirigent proteins (DIRs) 异源表达产量低、糖基化不均一的问题，并表征两种新的棉属DIRs在棉酚atropselective形成中的功能。
研究策略
利用工程化毕赤酵母Pichia pastoris GlycoSwitch® SuperMan5菌株进行补料分批发酵，表达密码子优化的GbDIR2和GhDIR3，通过金属螯合亲和纯化获得蛋白，结合酶法去糖基化、质谱鉴定和活性分析研究其功能。
核心内容
本研究利用工程化毕赤酵母GlycoSwitch® SuperMan5菌株，通过补料分批发酵实现了两种新的棉属dirigent proteins（GbDIR2和GhDIR3）的高效异源表达。针对该菌株的甲醇敏感性，研究优化了甲醇流加策略，经金属螯合亲和纯化后，GbDIR2和GhDIR3的产量分别达到12 mg/L和15 mg/L，较植物细胞培养系统提高了60至75倍。活性分析表明，两种蛋白在漆酶/O₂存在下均能介导(+)-gossypol的atropselective形成，对映体过量随蛋白量增加而饱和，分别达到80%和85%。质谱鉴定出5至6个N-糖基化位点，主要糖型为Man5GlcNAc2，但亦存在Man4-10GlcNAc2的不均一性。值得注意的是，酶法去糖基化后两种蛋白的活性并未丧失，表明N-糖基化并非其催化活性所必需。该表达系统不仅解决了dirigent proteins异源表达产量低和糖基化不均一的问题，为蛋白质结构与功能关系研究提供了充足且均一的材料，也为棉酚选择性生物合成及相关生物技术应用奠定了基础。
创新点
首次在Pichia pastoris SuperMan5中高效表达两种新的棉属dirigent proteins；优化了甲醇流加策略以适应菌株的甲醇敏感性；发现GbDIR2和GhDIR3的N-糖基化并非活性所必需，去糖基化后活性保持；获得高产量（12和15 mg/L）且糖型较均一的蛋白，有利于结构研究。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris GlycoSwitch® SuperMan5 | 棉酚生物合成 | GbDIR2 | GbDIR2 | 催化 | 来自Gossypium barbadense，介导hemigossypol自由基的atropselective偶联生成(+)-gossypol，产量12 mg/L，ee达80%。 |
| Pichia pastoris GlycoSwitch® SuperMan5 | 棉酚生物合成 | GhDIR3 | GhDIR3 | 催化 | 来自Gossypium hirsutum，介导hemigossypol自由基的atropselective偶联生成(+)-gossypol，产量15 mg/L，ee达85%。 |
| — | 酚氧化 | laccase | Trametes versicolor laccase | 催化 | 提供氧化活性，将hemigossypol氧化为自由基，dirigent proteins本身缺乏氧化活性，依赖漆酶/O2系统。 |
关键发现
- GbDIR2和GhDIR3经补料分批发酵纯化后产量分别为12 mg/L和15 mg/L
- 两者均介导(+)-gossypol的atropselective形成，对映体过量(ee)随蛋白量增加而饱和，分别达到80%和85%
- 在漆酶/O2存在下表现出活性，缺乏氧化活性
- 去糖基化后活性不变，且更为均一
- 质谱鉴定出5-6个N-糖基化位点（N60、N64/N65、N104、N121、N168），主要糖型为Man5GlcNAc2（在GbDIR2 N168位占>90%），但亦有Man4-10GlcNAc2
- 最终细胞密度达285 g/L（GbDIR2）和193 g/L（GhDIR3）
- 与植物细胞培养系统相比，产量提高60-75倍。
研究结论
建立了利用工程化毕赤酵母SuperMan5高效表达棉属dirigent proteins的系统，两种新蛋白GbDIR2和GhDIR3在棉酚的atropselective合成中具有(+)-gossypol选择性，且糖基化非活性必需。这一系统为dirigent proteins的结构与机制研究及生物技术应用奠定了基础。