Genome editing approaches: manipulating of lovastatin and taxol synthesis of filamentous fungi by CRISPR/Cas9 system
- 作者
- Ashraf S. A. El-Sayed, Salah E. Abdel-Ghany, Gul Shad Ali
- 杂志
- Applied Microbiology and Biotechnology（2017）
- DOI
- 10.1007/s00253-017-8263-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
丝状真菌中洛伐他汀和紫杉醇等次级代谢产物的生物合成基因簇在标准实验室条件下处于沉默状态，产量低，难以满足全球需求，需要高效的基因组编辑技术来精准调控代谢途径以提高产量。
研究策略
系统综述了多种基于核酸酶的基因组编辑技术（大范围核酸酶、ZFNs、TALENs、RNAi及CRISPR/Cas9），重点阐述CRISPR/Cas9系统的原理、类型、结构及其在丝状真菌基因组编辑中的应用，并探讨通过激活沉默基因簇、过表达限速酶和阻断竞争途径来提高洛伐他汀和紫杉醇产量的策略。
核心内容
该研究系统综述了基于核酸酶的基因组编辑技术在丝状真菌次级代谢产物生物合成中的应用，重点聚焦于CRISPR/Cas9系统在洛伐他汀和紫杉醇代谢工程中的潜力。丝状真菌中大量次级代谢基因簇在标准实验室条件下处于沉默状态，导致目标产物产量低下，而传统诱变和RNA干扰等方法效率有限且特异性不足。作者详细梳理了从大范围核酸酶、ZFNs、TALENs到CRISPR/Cas9的技术演进，并总结了后者在多种丝状真菌中的编辑效率：烟曲霉pksP基因靶向产生白化突变体效率约53%，同框整合率超过95%；构巢曲霉yA基因突变效率达80%以上；里氏木霉URA5基因突变效率高达100%；敲除Ku70/Ku80蛋白可使同源重组频率达到100%。文中还指出曲霉基因组约35 Mb、含约50个次级代谢基因簇，而丝状真菌已发现的次级代谢物超过45,000种，说明沉默基因簇的激活空间巨大。该工作表明，CRISPR/Cas9系统能够通过激活沉默基因簇、过表达限速酶或阻断竞争途径，为将洛伐他汀和紫杉醇产量提升至工业规模提供了可行的技术路径。
创新点
首次全面总结了用于丝状真菌基因组编辑的多种策略，并前瞻性地提出CRISPR/Cas9系统在洛伐他汀和紫杉醇代谢工程中实现工业规模生产的应用潜力。
研究对象（17）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 烟曲霉（Aspergillus fumigatus） | 聚酮色素生物合成 | pksP | 聚酮合成酶 | 催化 | CRISPR/Cas9靶向效率约53%，产生无色白化突变体 |
| 构巢曲霉（Aspergillus nidulans） | 分生孢子色素生物合成 | yA | p-联苯酚氧化酶 | 催化 | CRISPR/Cas9突变效率>80%，产生黄色分生孢子 |
| 棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus） | 黑色素生物合成 | alba | 黑色素合成相关蛋白 | 催化 | 与pyrG基因共同被CRISPR/Cas9编辑 |
| 棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus） | 嘧啶生物合成 | pyrG | 乳清苷-5'-磷酸脱羧酶 | 催化 | CRISPR/Cas9靶向突变 |
| 米曲霉（Aspergillus oryzae） | 分生孢子色素生物合成 | wA | 聚酮合成酶（推测） | 催化 | CRISPR/Cas9靶向突变 |
| 米曲霉（Aspergillus oryzae） | 分生孢子色素生物合成 | yA | p-联苯酚氧化酶 | 催化 | CRISPR/Cas9靶向突变 |
| 米曲霉（Aspergillus oryzae） | 嘧啶生物合成 | pyrG | 乳清苷-5'-磷酸脱羧酶 | 催化 | CRISPR/Cas9靶向突变 |
| 里氏木霉（Trichoderma reesei） | 嘧啶生物合成 | URA5 | 乳清苷单磷酸焦磷酸化酶 | 催化 | CRISPR/Cas9效率100%，可用5-FOA培养基筛选 |
| 土曲霉（Aspergillus terreus） | 洛伐他汀生物合成 | lovB | 洛伐他汀非内酯合成酶（LNKS） | 催化 | I型聚酮合成酶，335 kDa，催化主链组装 |
| 土曲霉（Aspergillus terreus） | 洛伐他汀生物合成 | lovC | 烯酰还原酶 | 催化 | 与lovB协同提供还原功能 |
| 土曲霉（Aspergillus terreus） | 洛伐他汀生物合成 | lovD | 硫酯酶 | 催化 | 参与产物释放 |
| 土曲霉（Aspergillus terreus） | 洛伐他汀生物合成 | lovA | 细胞色素P450加氧酶 | 催化 | 催化氧化修饰 |
| 土曲霉（Aspergillus terreus） | 洛伐他汀生物合成 | lovF | 聚酮合成酶 | 催化 | 负责2-甲基丁酸侧链合成 |
| 土曲霉（Aspergillus terreus） | 洛伐他汀生物合成 | lovE | 转录因子 | 调控 | 调控洛伐他汀基因簇表达 |
| 土曲霉（Aspergillus terreus） | 洛伐他汀生物合成 | lovH | 转录因子 | 调控 | 调控洛伐他汀基因簇表达 |
| 粗糙脉孢菌（Neurospora crassa） | DNA修复（非同源末端连接） | ku70/ku80 | Ku70/Ku80蛋白复合体 | 调控 | 敲除后同源重组频率可高达100% |
| 多种丝状真菌 | 基因组编辑 | cas9 | Cas9核酸内切酶 | 催化 | RNA引导的DNA核酸酶，用于精准基因组编辑 |
关键发现
- CRISPR/Cas9系统已在多种丝状真菌中成功应用：在烟曲霉中靶向pksP基因产生白化突变体，效率约53%，同框整合率>95%
- 在构巢曲霉中yA基因突变效率>80%
- 在棘孢曲霉中alba和pyrG基因被成功编辑
- 在米曲霉中wA、yA、pyrG基因被同时突变
- 在里氏木霉中URA5基因突变效率达100%。敲除粗糙脉孢菌Ku70/Ku80蛋白可使同源重组频率高达100%。丝状真菌已发现超过45,000种次级代谢物
- 曲霉基因组约35 Mb，含有约50个次级代谢基因簇。植物中CRISPR/Cas9突变率约13%，N. benthamiana原生质体PEG转化突变率达37.7%，农杆菌浸润仅4.8%
- PAM序列在植物基因组中每100 bp出现5-12次。
研究结论
CRISPR/Cas9系统作为高效的RNA引导基因组编辑工具，在丝状真菌代谢工程中展现出巨大潜力，可用于激活沉默的次级代谢基因簇、过表达限速酶或阻断竞争途径，从而将洛伐他汀和紫杉醇的产量提升至工业规模。